PHLPP2在人胶质瘤中的表达及意义

辛海滨梁俊君刘 伟*

（1 青岛大学医学院神经外科，山东 青岛 266071；2 青岛大学医学院附属医院神经外科，山东 青岛 266071）

PHLPP2在人胶质瘤中的表达及意义

辛海滨1梁俊君1刘 伟2*

（1 青岛大学医学院神经外科，山东 青岛 266071；2 青岛大学医学院附属医院神经外科，山东 青岛 266071）

目的研究PHLPP2在人正常脑组织以及脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法选取青岛大学附属医院与安丘人民医院神经外科自2014年12月至2016年10月间手术切除并经病理证实的人脑胶质瘤标本56例，其中I级7例，Ⅱ级19例，Ⅲ级21例，胶质母细胞瘤9例。另取20例因脑创伤行内减压术患者的正常脑组织标本作为对照。应用RT-PCR、Western-blotting分别检测各标本中PHLPP2mRNA和PHLPP2蛋白的表达。结果RT-PCR和Western-blotting检测结果显示正常脑组织中PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表达最高，不同级别胶质瘤组织PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表达差异有统计学意义（P<0.05），且随着肿瘤病理级别的增高，胶质瘤组织中PHLPP2 mRNA和PHLPP2蛋白表达值降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论PHLPP2在正常脑组织和不同级别的脑胶质瘤组织中都有表达，其表达值与肿瘤的病理分级呈负相关，PHLPP2可能作为一个肿瘤抑制基因在胶质瘤的发生、发展中起到关键性的作用。

神经胶质瘤；PHLPP2；基因表达

胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，其发病率和病死率在原发性中枢神经系统肿瘤占首位[1]，随着现代科学的飞速发展，人们对脑胶质瘤的病因及发病机制的深入研究及手术切除为主要治疗手段的综合治疗方法的不断改进，使本病的诊断和治疗取得了很大的进步。但是，将来基因靶向治疗的途径可能在胶质瘤的治疗中起关键作用。

PHLPP2属于一个色氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族：PHLPP（PH domain leucine-rich repeats protein phosphatase），这个磷酸酶家族可以通过抑制AKT和PKC信号通路而对肿瘤起到抑制作用。PHLPP家族有两个亚型：PHLPP1 和 PHLPP2。PHLPP2位于染色体16q22.3[2-3]。在各种癌症中，编码PHLPP1和PHLPP2的染色体基因经常丢失。在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌和Wilms瘤的病例中也证实有PHLPP2的杂合性丢失[4-16]。PHLPP2在肿瘤的发病机制中的准确作用还在研究中，一些研究表明，它能够对AKT和PKC信号通路起到负调控的作用通过直接使AKT和PKC去磷酸化而起作用[4-7]。现在我们对于PHLPP2在胶质瘤中作用方面的信息了解很少。本实验就是要研究PHLPP2是否在胶质瘤中出现，并且观察PHLPP2的表达是否与肿瘤的恶性程度有关。

1 材料与方法

1.1 临床资料和肿瘤样本的采集：所有胶质瘤组织标本取自青岛大学附属医院和安丘人民医院神经外科手术切除并经过病理证实的人脑胶质瘤液氮冻存标本 56 例。其中男24例，女32例，年龄5～75岁，所有患者术前都未进行化疗和放疗。另取 20 例因脑创伤行内减压术患者的正常脑组织液氮冻存标本作为对照。按照WHO（2000）标准进行病理分级分成星形胶质瘤Ⅰ～Ⅲ级和胶质母细胞瘤[8]。其中Ⅰ级 7 例，Ⅱ级 19 例，Ⅲ级 21 例，胶质母细胞瘤 9 例。

1.2 材料与试剂：RT-PCR试剂盒购自上海生工生物技术有限公司，引物由上海生工生物技术有限公司合成。兔抗人PHLPP2多克隆抗体（1∶3000稀释），鼠抗人β-actin多克隆抗体（1∶4000稀释），羊抗鼠IgG二抗，羊抗兔IgG二抗购自美国abcam公司。

1.3 试验方法

1.3.1 RT-PCR检测：液氮下研磨粉碎组织块，Trizol法提取RNA。AMV两步法检测PHLPP2 mRNA的表达。反应体系：2×Taq酶12.5 μL，模板RNA 10 pg～1 μg，PHLPP1上游引物（10 μmol/L）：GACAAGACGCCAAGTCATCC 1 μL，PHLPP1下游引物（10 μmol/L）：GTTCCAGGCTACAACACGAGA 1 μL，DEPC处理的无菌双蒸水至25 μL。（β-actin上游引物：CTGGGACGACATGGAGAAAA；下游引物：AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC）。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s（β-actin是60 ℃），72 ℃延伸50 s，共35个循环（β-actin是30个循环），72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3.2 Western-blotting检测蛋白表达：组织块称重后液氮下研磨粉碎组织块，然后加入500 μL RIPA组织裂解液，冰上放置30 min。裂解物4 ℃ 12000 g离心30 min，Bradford法测蛋白浓度，4×上样缓冲液调整蛋白浓度至一致，8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，3%的BSA封闭2 h，兔抗人PHLPP2多克隆一抗（鼠抗人β-actin多克隆一抗）4 ℃孵育过夜，洗膜，羊抗兔IgG（羊抗鼠）二抗室温孵育2 h，洗膜，曝光。RT-PCR和Western-bloting的检测结果均以“PHLPP2的吸光度值/β-actin的吸光度值”表示。

2 结 果

2.1 PHLPP2 mRNA在非肿瘤脑组织和胶质瘤组织中的表达。RT-PCR检测结果见图1显示：非肿瘤脑组织中PHLPP2的表达量最高，随着胶质瘤级别的升高，PHLPP2的表达量呈递减的趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。统计结果见图2。

图 1 PHLPP2 mRNA在非肿瘤脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达

图2 统计结果

图3 PHLPP2 蛋白质在非肿瘤脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达

图4 统计结果

2.2 PHLPP2蛋白质在非肿瘤脑组织和胶质瘤组织中的表达。Westernblotting检测结果见图3显示：PHLPP2蛋白在非肿瘤脑组织中的表达量最高，不同级别胶质瘤组织中PHLPP2蛋白表达有统计学差异（P<0.05），且随着胶质瘤恶性程度的升高，PHLPP2蛋白表达量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。统计结果见图4。

3 讨 论

PHLPP（PH domain leucine-rich repeats protein phosphatase）是一个色氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族，这个磷酸酶家族可以同过抑制AKT和PKC信号通路而对肿瘤起到抑制作用。PHLPP家族有两个亚型：PHLPP1 和 PHLPP2。PHLPP2位于染色体16q22.3，细胞定位实验研究表明，PHLPP2在细胞质、细胞核和细胞膜中都有存在，而且它在很多细胞系中都有表达，包括大脑、肺、乳腺、前列腺和卵巢中[2-3]。

PHLPP抑制癌症的作用最早被提及是从PHLPP的两个亚型能够负调控AKT和PKC开始的[2-3]。PHLPP1和PHLPP2能够使细胞中的AKT去磷酸化从而导致AKT活性的降低。在各种癌症中，编码PHLPP1和PHLPP2的染色体基因经常丢失。在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌和Wilms瘤的病例中也证实有PHLPP2的杂合性丢失[12-16]。2个亚型在众多的细胞系检测中都有表达，包括大脑、肺、乳腺、前列腺和卵巢等癌症的细胞系[2-3]。同样，这两种亚型在人体的大部分组织中都有表达。PHLPP表达的缺失在肿瘤发展的早期可能对肿瘤的发生、发展是个有利条件，但是在肿瘤后期的转移中它可能会有不同的作用，这是在对乳腺瘤的发生，转移的研究中通过对AKT1和AKT2的研究中发现的[9-10]。最近研究表明，给大鼠服用硝酸镧药物后其体内PHLPP2的水平增加23倍[17]。镧化合物是已知的导致细胞凋亡和抑制细胞增殖的化合物之一[18-19]，这些作用是否通过增加PHLPP2的水平来实现还有待于证实。鉴于药物发现模式从特异性抑制剂到泛抑制剂，导致癌症中多种信号转导通路受牵连[20]。激活或增加PHLPP的小分子化合物的发现能导致多种癌症相关信号转导通路的失活。

PHLPP2基因在胶质瘤以及其他肿瘤发病机制中准确的作用还不是很清楚，PHLPP2在胶质瘤组织中表达的意义和临床含义还未被证实。PHLPP2可能作为一个肿瘤抑制基因在胶质瘤的发生、发展中起作用，它通过对AKT和PKC的影响而起作用。但是，PHLPP2可能不是在胶质瘤中唯一起作用的抑癌基因，因为除了PHLPP2，16q22.3-16q23.1区域还有其他肿瘤抑制基因，如BCAR1[12]。

本实验研究表明，PHLPP2的mRNA和蛋白质在非肿瘤脑组织中的表达比星形胶质瘤组织以及胶质母细胞瘤中的表达高，且随着胶质瘤病理级别的增高，其mRNA和蛋白质表达逐渐降低。这个结果表明PHLPP2可能作为一个肿瘤抑制基因在肿瘤的发生、发展中起到关键性的作用，所以它可能作为一个预测肿瘤严重程度以及判断患者预后的生物学指标。这样我们就能从更多的介入点入手对肿瘤的发生进行预防，也可以起到抑制肿瘤发展的目的。

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Expression and Significance of PHLPP2 in Human Gliomas

XIN Hai-bin1, LIANG Jun-jun1, LIU Wei2*
(1 Department of Neurosurgery, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China; 2 Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China)

ObjectiveTo investigate the expression of PHLPP2 in the tumor tissues of patients with gliomas and evaluate its clinical significance.MethodsFifty-six patients with brain gliomas(7 with grade I,19 grade Ⅱ,21 grade Ⅲ and 9 with glioblastoma)performed surgical excision in Our hospitals from December 2014 to October 2016 were chosen and 20 case of normal brain tissues from patients performed decompression operation resulting from cerebral hernia were selected as the controls in our experiment.RT-PCR and Western-blotting were used to detect the mRNA and protein expressions of PHLPP2.ResultsThe results investigated by RT-PCR and Westem-blotting were consistent, the highest expression of PHLPP2 was in the normal brain tissues. The expression value between different grades of tumors was obviously significant and decreased in a grade-dependent manner(P<0.05).ConclusionThe mRNA and protein expressions of PHLPP2 are noted with positive correlation to the pathological grades of the gliomas, indicating that PHLPP2 may play an important role in the generation and development of gliomas.

Neuroglioma; PHLPP2; Gene expression

R739.41

B

1671-8194（2017）12-0034-03

*通讯作者