牛樟芝固态发酵产物中安卓奎诺尔的超声提取工艺*

魏海龙，胡传久，程俊文，贺 亮，钱 华，李海波，王衍彬，邹景泉，蒋云鹤

（浙江省林业科学研究院浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室，浙江 杭州 310023）

牛樟芝固态发酵产物中安卓奎诺尔的超声提取工艺*

魏海龙，胡传久**，程俊文，贺 亮，钱 华，李海波，王衍彬，邹景泉，蒋云鹤

（浙江省林业科学研究院浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室，浙江 杭州 310023）

在单因素试验的基础上，通过Box－Benhnken组合设计和响应曲面分析法优化牛樟芝（Antrodia camphorata）固态发酵产安卓奎诺尔的发酵工艺条件。响应面分析结果表明，牛樟芝中安卓奎诺尔最佳提取条件为：提取温度26.48℃，料液比1∶25.3，超声时间27.95 min。此条件下的验证试验表明，安卓奎诺尔的产量为283.24 mg·kg－1，与理论值基本吻合。

牛樟芝；安卓奎诺尔；提取工艺

牛樟芝（Antrodia camphorate） 为中国台湾道地药材，又名樟芝、樟菇、牛樟菇、红樟芝、血灵芝，属于真菌界（Fungi） 担子菌门（Basidiomycota） 担子菌亚门（Basidiomycotina）同担子菌纲（Homobasidiomycetes）无褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科（Polyporaceae） 薄孔菌属（Antrodia）[1]。牛樟芝生长于我国台湾省深山特有的“国宝”级树种（百年以上）牛樟树上，且生长极为缓慢，形成子实体的时间相当长[2]。牛樟芝在民间应用历史已有200年，台湾原住民认为牛樟芝具有解酒、解食物中毒、止腹泻和止吐作用，可以治疗肝脏病变以及缓解体力透支症状[3]。由于牛樟芝功效显著、产量小且价格昂贵，被誉为“森林中的红宝石”。现代药理研究表明，牛樟芝子实体含有较多的生理活性物质，具有抗肿瘤、保肝、免疫调节、降血压、降胆固醇、抑制血小板凝集等生理活性，自1990年开始逐渐成为台湾研究最热门的抗癌药物和保健品之一。

2007年，Lee等[4]采用正己烷萃取樟芝产物，得到1个新化合物安卓奎诺尔 (antroquinonol），属于泛醌类化合物。2012年，Lin等[5]研究发现Antrodin C能够显著抑制乳腺癌细胞的生长速度。2009年，Phuong等[6]的研究表明活性物质 Antrodin A～E具有良好的保肝活性。

响应曲面法 （response surface methodology，RSM）是1种优化生物过程的统计学试验设计，采用该法可建立连续变量曲面模型，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围，而且所需要的试验组数相对较少，可节省人力物力，因此该方法已经成功应用于各种的生物过程优化中[7-9]。本实验以安卓奎诺尔为目标产物，利用Box-Behnken设计和响应面法优化提取条件，为以后的提取放大实验奠定基础

1 材料和方法

1.1 供试菌株

牛樟芝（Antrodia camphorate），由浙江省林业科学研究院实验室保藏。

1.2 培养基

1.2.1 斜面菌种PDA培养基

用于活化菌种。

1.2.2 液体摇瓶培养基

KH2PO41 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、马铃薯100 g·L-1、葡萄糖15 g·L-1、酵母粉5 g·L-1。

1.2.3 固体发酵培养基

KH2PO41 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、葡萄糖15 g·L-1、玉米粒100 g·L-1、麸皮300 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1。

1.3 培养方法

1.3.1 斜面培养

在超净工作台上，从母种试管中取出蚕豆大小的菌丝块接种于斜面培养基的中部，在26℃培养5 d。

1.3.2 液体摇瓶种子培养

将已经活化的菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种于液体摇瓶培养基中，500 mL三角瓶装培养基150 mL，于26℃，120 r·min-1培养6 d。

1.4 实验设计

综合单因素试验结果，选择提取温度、料液比、超声时间3个因素所确定的水平范围，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用三因素三水平的响应面设计，利用Design Expert 8.05软件对实验数据进行回归分析。自变量的试验水平分别以-1、0、1进行编码，试验因素和水平设计见表1。

表1 响应面分析因子和水平表Tab.1 Factors and levels of RSM analysis

1.5 分析方法

1.5.1 生物量的测定

将培养好的菌丝体真空冷冻干燥至恒重，电子天平称重。

1.5.2 安卓奎诺尔的分析检测方法

采用高效液相色谱（HPLC）法测定牛樟芝产品中安卓奎诺尔产量。取樟芝固态发酵粉末5 g，加入无水乙醇90 mL，在30℃的DKZ-2型电热恒温振荡水槽内振荡提取45 min，静置后0.22 μm微膜过滤，进行HPLC分析，具体分析条件参照文献[10]。

2 结果与分析

2.2 响应面分析试验结果

2.2.1 响应面分析方案和结果

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计三因素三水平的响应面分析试验。共有17个试验点，其中12个为析因点，5个零点试验用以估计试验误差。以安卓奎诺尔产量为响应值，试验方案及结果见表2。

2.2.2 回归模型建立和方差分析

利用Design Expert 8.05软件对表2实验数据进行分析[11]，获得安卓奎诺尔产量对提取温度、料液比和超声时间的多元二次回归方程：安卓奎诺尔含量(mg·kg-1)=283.12-25.38X1+4.71+13.94X2-17.81X3+ 14.21X1X2-6.81X1X3+6.10X2X3-13.82X1X1-9.54X2X2-28.96X3X3。回归模型方差分析见表3。

由表3方差分析可知，以安卓奎诺尔产量为目标函数的回归方程的回归效果达到极显著水平，P值均＜0.0001；模型的决定系数R2=0.9490，说明模型与实际实验拟合较好；校正决定系数AdjR2=0.9038，说明该模型能解释90.38%响应值的变化；模型的失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表3中模型失拟项的P值为0.1875，大于0.05，表明模型的失拟项不显著；根据表3的显著性分析结果，各因素的一次项、X1X1、X3X3以及X1X2的交互项对安卓奎诺尔的提取均具有显著影响（P＜0.05）；综合以上表明这个模型建立的回归方程能运用于牛樟芝固态发酵产安卓奎诺尔条件优化的理论预测。

表2 响应面试验设计方案及试验结果Tab.2 Experiment design and results of RSM

表3 回归模型方差分析Tab.3 Analysis variance on regression model

2.2.3 响应面图形分析

分别将模型中的提取温度、料液比和超声时间的其中1个因素固定在0水平，得到另外2个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线见图1～图3。各个因素及其相互间的交互作用对响应值的影响结果通过图1～图3可以直观地反映出来。极值条件应该在等高线的圆心处。

由图1～图3可以看出，影响牛樟芝发酵产安卓奎诺尔最显著的因素为超提取温度（X1），表现为响应面变化弧度较大。其次为超声时间（X3）和料液比（X2）。此外，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示二因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图1～图3可以看出，X1与X2交互作用显著。

图1 提取温度和料液比交互影响安卓奎诺尔产量的曲面图和等高线图Fig.1 Response surface and contour for antroquinonol as a function of extraction temperature and solid-liquid ratio

图2 提取温度和超声时间交互影响安卓奎诺尔产量的曲面图和等高线图Fig.2 Response surface and contour for antroquinonol as a function of extraction temperature and ultrasonic time

图3 料液比和超声时间交互影响安卓奎诺尔产量的曲面图和等高线图Fig.3 Response surface and contour for antroquinonol as a function of solid-liquid ratio and ultrasonic time

2.2.4 验证实验

通过SAS软件对上述方程进行求解，得到最佳提取条件为：提取温度26.48℃，料液比1∶25.3，超声时间27.95 min，安卓奎诺尔提取产量理论值可达295.97 mg·kg-1。

为检验模型预测值与实际实验值之间的相关性，即检验响应面优化模型的可靠性，对牛樟芝在预测的最优发酵条件下安卓奎诺尔产量进行实验验证。实验中提取温度、料液比和超声时间的优化值分别为 26.48℃、1:25.3、27.95 min，3组平行实验，测得安卓奎诺尔产量分别为289.86 mg·kg-1、280.53 mg·kg-1、279.34 mg·kg-1，实际安卓奎诺尔产量平均值为283.24 mg·kg-1，达到了回归模型预测理论值的95.7%，实验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地模拟和预测牛樟芝安卓奎诺尔产量。

3 结论

本实验对牛樟芝固态发酵产物中产安卓奎诺尔的提取工艺条件进行了优化，结合生产实践，选择提取温度、料液比、超声时间为3个主要参数，根据Box-Benhnken中心组合实验设计和三因素三水平的响应面分析，通过二次多项回归模型进行方差分析和回归拟合，预测了牛樟芝中安卓奎诺尔最佳提取条件为：提取温度26.48℃，料液比1:25.3，超声时间27.95 min，安卓奎诺尔产量理论值可达295.97 mg·kg-1。验证实验中安卓奎诺尔产量283.24 mg·kg-1，与预测值十分接近，证明了该实验方法的稳定性。

[1]Lu M,El-Shazly M,Wu T,et al.Recent research and development of Antrodia cinnamomea[J].PharmacolTherap,2013, 139(2):124-156.

[2]胡欧，连张飞，张君逸，等.樟芝的药用保健价值及开发应用（综述）[J].亚热带植物科学，2006，35（4）：75-78.

[3]理筱龙.牛樟芝之简介 [C]//首届药用真菌产业发展暨学术研讨会论文集.南通：中国菌物学会，2006.

[4]Lee TH,Lee CK,Tsou WL.A new cytotoxic agent from solidstate fermented mycelium of Antrodia camphorata[J].Planta Medica,2007,73(13):1412-1415.

[5]Lin WL,Lee YJ,Wang SM,et al.Inhibition of cell survival, cell cycle progression,tumor growth and cyclooxygenase-2 activity in MDA-MB-231 breast cancer cells by camphorataimide B[J].Eur J Pharmacol,2012,680(1-3):8-15

[6]Phuong DT,Ma CM,Hattori M,et al.Inhibitory effects of antrodins A-E from Antrodia cinnamomea and their metabolites on hepatitis C virus protease[J].Phytotherapy Research, 2009,23(4):582-84

[7]Liang RenJie.Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra polysaccharides by response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2008(74):858-861.

[8]程俊文，贺亮，李肖娟，等.响应面法优化灵芝胞外多糖的发酵工艺条件[J].中国林副特产，2014（1）：22-25.

[9]程俊文，侯寒黎，邹景泉，等.桑黄胞外多糖发酵条件优化研究[J].浙江林业科技，2014（5）：16-20.

[10]夏永军，李炜疆，许赣荣.樟芝固态发酵产品活性代谢产物分析[J].食品与发酵工业,2011，37（8）：86-90.

[11]费荣昌.实验设计与数据处理（第四版）[M].无锡：江南大学出版社，2001：59-63.

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction Process of Antroquinonol from Antrodia camphorata Solid-state Fermentation Products

WEI Hai-long,HU Chuan-jiu,CHENG Jun-wen,HE Liang,QIAN Hua, LI Hai-bo,WANG Yan-bin,ZOU Jing-quan,JIANG Yun-he
(Zhejiang Forestry Academy,Zhejiang Province Key Laboratory of Forest Food,Hangzhou 310023,China)

Based on the results of single factor analysis method,a Box－Behnken factorial design of three level was employed combining with response surface methodology(RSM)to optimize the extraction process conditions of Antrodia camphorate for producing antroquinonol.The optimal extraction conditions were determined as follows:extraction temperature 26.48℃,solid liquid ratio 1:25.3,ultrasonic time 27.95 min.Verification test demonstrated that the average yield of antroquinonol was 283.24 mg·kg－1,similar to theoretical value of 295.97 mg·kg－1.

Antrodia camphorate;antroquinonol;extraction process

S646.9

A

1003-8310（2017）03-0060-05

10.13629/j.cnki.53－1054.2017.03.015

浙江省科技厅公益技术研究项目（2013C32095）；浙江省食用菌新品种选育项目（2016C02057－8）。

魏海龙（1974－），男，硕士，副研究员，主要从事食用药用菌栽培方面研究。E－mail:whlwlp＠163.com

**通信作者：胡传久（1982－），男，硕士，副研究员，主要从事食用药用菌培育与加工方面研究。E－mail:huchuanjiu＠163.com

2017－03－15