儿童手足口病病原体的检测及致病影响因素研究

桂莹++肖曼丽++秦原

[摘要] 目的 建立快速有效的手足口病病原體检测方法，并探讨手足口病病原体在儿童中的影响因素及防控措施。 方法 选择2015年3～11月在湖北大学医院感染科确诊的手足口病患儿为研究对象，从中随机抽取200例进行研究。本研究采用荧光定量RT-PCR方法对200份手足口病患者标本进行肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒普通组16型（CVA16）检测，同时，对病例进行Logistic回归分析来确定危险因素。 结果 200例粪便标本检测共检出EV71和CoxA16阳性标本共计153例。其中，普通组感染46例，重型组感染66例，危重型组感染41例。EV71阳性标本感染91例，CoxA16阳性标本共78例。Logistic回归分析显示，在所有调查的影响因素中，体质弱、早产、病例接触史、居住环境差、个人卫生差5个为手足口病危险因素（P < 0.05）。 结论 荧光定量RT-PCR方法具有特异性强，灵敏度高，重复率好的优点，非常适合手足口病病原体的检测；EV71病原体毒力更强，对患儿身体具有更大的破坏性，可引起严重并发症；儿童监护人应为儿童提供一个良好的居住环境和个人卫生，注意儿童膳食营养，避免与手足口病患儿接触，有相关症状应及时入院检查。

[关键词] 手足口病；EV71；CVA16；荧光定量RT-PCR；影响因素

[中图分类号]R725 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0105-05

[Abstract] Objective To establish a rapid and effective method for the detection of pathogens in hand-foot-mouth disease， and to explore the influencing factors and control measures of hand-foot-mouth disease pathogens in children. Methods 200 patients in children diagnosed with hand-foot-mouth disease in Hubei University Hospital from March to November 2015 were randomly selected. In this study， Enterovirus 71 （EV71） and Coxsackie virus 16 （CVA16） in 200 hand-foot-mouth disease patients were tested by Quantitative real-time PCR. Logistic regression analysis was also performed to determine the risk factor. Results The results showed that a total of 153 cases of EV71 and CoxA16 positive specimens were detected in 200 stool specimens. Among them， 46 cases of common group infection， 66 cases of heavy group infection， 41 cases of severe group infection. EV71 positive specimens were 91 cases， and CoxA16 positive specimens were 78 cases. Logistic regression analysis showed that among all the influencing factors， the 5 risk factors of hand-foot-mouth disease were poor health， premature delivery， history of contact patient， poor living condition， and poor personal hygiene （P < 0.05）. Conclusion The quantitative real-time PCR method has the advantages of strong specificity， high sensitivity and good repeatability， and is very suitable for the detection of pathogens of hand-foot-mouth disease； EV71 pathogen is more virulent and more destructive to the children， and can cause serious complications； children guardians should provide children with a good living environment and a good personal hygiene， pay attention to children's nutrition， avoid contact with children with hand-foot-mouth disease， if children have associated symptoms， they should be promptly admitted to hospital.

[Key words] Hand-foot-mouth disease； EV71； CVA16； Quantitative real-time PCR； Influencing factor

手足口病是一种受多种肠道病毒引起的传染病，该传染病可引起患者手、足、口腔等部位产生皮疹和溃疡，并伴有发热等一系列并发症，多发生于5岁以下的婴幼儿[1-4]。手足口病以柯萨奇A16（CoxA16）和肠道病毒71型（EV71）为主要病原体[5-7]。两者引起的手足口病在临床症状方面较为相似，但EV71感染除了引起手足口病外，还能引起多种与神经系统相关的症状[8-10]。CoxA16型病原体先于EV71发现，至1969年美国首次确认EV71与手足口病有关后，EV71感染与CoxA16感染交替出现，蔓延至世界各地[11]。近年来，我国多个省份出现了儿童感染EV71病毒的状况，严重影响儿童的身体健康。但是，目前对引起手足口病的肠道病毒既无有效疫苗，又无特效预防药物本病的方法。

目前，手足口病实验室检测主要采用病毒分离培养、血清学方法和普通RT-PCR方法。病毒分离培养和血清学方法无法及时对暴发疫情作出诊断，因其自身具有耗时长、技术要求高等限制因素；而普通RT-PCR方法虽然具有敏感、特异等优点，但步骤繁琐、耗时长、易交叉污染等，荧光定量RT-PCR技术是新兴针对病原体核酸的快速检测技术，该方法具有定量检测、快速、灵敏度高、特异性强以及自动化程度高的特点，已在其他领域被广泛应用，但在手足口病病原体检测方面应用较少[12-13]。

因此，为了建立快速有效的手足口病病原体检测方法，用于手足口病的精准检测，并探讨手足口病病原体在儿童中的影响因素及有效防控措施。本研究采用荧光定量RT-PCR方法对200份病例进行检测，并通过对病例进行Logistic回归分析，以期为儿童手足口病病原体的检测和防控提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取湖北大学医院感染科2015年3～11月收治的200例患儿作为研究对象，其中男110例，女90例，年龄<3岁143例，≥3岁57例。参考《手足口病诊疗指南》（2010年版）中记录的诊断标准，依据不同患病程度和类型将病例分为普通组、重型组和危重型组。普通组发病情况较轻，主要是手足口等部位出现皮疹；重型组患儿有头痛、嗜睡、身体无力、呕吐等神经系统损伤症状；危重型组有神经系统损伤症状并且伴有呼吸困难、频繁抽出、咳血等严重并发症状。最终确定普通组66例，重型组84例，危重型组50例。采集普通组、重型组和危重型组患者的粪便标本，每份4～10 g，采集后放入无菌采便管内，记录编号、发病日期、采集日期信息，-20℃保存。

1.2 实验试剂与仪器

无水乙醇；生理盐水；氯仿；Trizol（北京百奥森泰生物技术有限公司）；肠道病毒71型核酸检测试剂盒、柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒、PCR检测试剂、阴性及EV71和CoxA16阳性质控品（上海贝西生物科技有限公司）；ABI-7300型PCR仪（Roche 公司）等。

1.3 标本处理

将水样粪便标本混匀，取100 μL置于1.5 mL离心管中，加入200 μL Trizol试剂及100 μL氯仿，震荡30 s后静置5 min，10 000 r/min离心3 min（离心半径7.7 cm），取出上清液转移至新的1.5 mL灭菌离心管中，加入10 μL RNA提取液，充分混匀，10 000 r/min离心3 min，弃去所有液体；加入酸提取试剂中的溶液C 400 μL，振荡混匀，8000 r/min离心2 min，弃去液体后将装有沉淀的离心管风干15 min，加入30 μL DPEC H2O，混匀，即得白色悬浊液。

1.4 PCR扩增体系的构建

在3个PCR反应管中分别加入20 μL RT-PCR反应液、2 μL逆转录酶、4 μL Taq酶系，然后依次分别加入5 μL处理后的阴性质控品、阳性质控品和1.3所得待测悬浊液，8000 r/min离心50 s，然后放入PCR扩增仪进行扩增。PCR反应循环设置：45℃ 30 min，90℃ 5 min，（90℃ 20 s，50℃ 50 s）×45 cycles。

标本的EV71和CoxA16检测步骤同上。引物及探针序列由中国疾病预防控制中心提供，EV71和CA16检测试剂扩增目的片段位于病毒的VP1基因保守区。

1.5 方法学考察

灵敏度试验：通过以10倍浓度梯度来稀释样品，至荧光定量PCR不能检出为止，并计算最低模板拷贝数；重复性试验：取同一份阳性样品，分10个重复分别检测，并计算获得的目的基因拷贝数的变异系数；特异性试验：提取并检测甲型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒RNA，来考察特异性。

1.6 问卷调查

自制调查问卷，由经过培训的工作人员对病例及法定监护人进行调查，调查内容包括患儿和家庭基本情况、出生情况、发病就诊治疗情况、托幼机构所在、有无既往病史、临床表现、个人卫生情况、发病前2周手足口病患者接触史等内容，并抽取10%回访进行质量控制。病例发病相关信息通过查阅病史获得。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计数资料采用χ2检验，采用Logistic回归分析对致病影响因素进行分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准曲线制备及标准品检测

利用病毒载量已知的标准品（107、106、105、104拷贝/mL）进行荧光定量RT-PCR检测，标准曲线结果显示，Ct值与病毒拷贝数的对数相关性较好，相关系数为0.997，阴性质控品在本试验中未检测出病毒（图1）。标准曲线线性公式为Y=2.133X+34.107（图2）。

2.2 方法学考察分析

灵敏度检测结果显示，最低模板拷贝数在荧光定量PCR仪上显示为1.2×102拷贝/mL，表明灵敏度良好。甲型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒RNA经上述RT-PCR检测，结果均为阴性，本试验特异性良好。利用上述方法，重復检测同一阳性样本10次，每次结果均在同一Ct值内，变异系数为3.6%，说明本次检测重复性良好。

2.3 粪便标本检测

200例粪便标本共检出EV71和CoxA16阳性标本153例。其中，普通组感染46例，包括EV71 12例，CoxA16 30例，混合感染4例；重型组共感染66例，包括EV71 37例，CoxA16 24例，混合感染5例；危重型组共感染41例，其中，EV71 26例，CoxA16 8例，混合感染7例（表1）。其中未检出的47例可能感染除EV71和CoxA16以外的其他手足口病致病病毒。

对手足口病患儿EV71和CoxA16检测数据进行分析，200例检测标本中，EV71阳性标本感染91例，包含了混合感染的病例，其中，普通组17例，重型组41例，危重型组33例（表2）；CoxA16阳性标本共78例，包含了混合感染的病例，其中，普通组34例，重型组30例，危重型组14例（表3）。

三組EV71阳性检出率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；重型组和危重型组EV71阳性检出率高于普通组，差异有统计学意义（P < 0.05）。三组CoxA16阳性检出率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；危重型组CoxA16阳性检出率高于普通组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2、表3。对于造成上述差异的原因，推测是EV71较CoxA16对儿童身体功能具有更大的破坏性，可引起多种与神经系统相关的症状[8-9]。

2.4 Logistic回归分析

对可能引起手足口病的若干因素逐一进行单因素Logistic回归分析。通过单因素分析筛选出8个可疑影响因素，其中，4个因素可能引起EV71感染。统计结果显示，普通组、重型组、危重型组在体质弱（1年内看病≥5次）、早产、个人卫生差、病例接触史、通风情况差、家长缺乏手足口防病知识、居住环境卫生差、居住环境差等8项上差异有统计学意义（P < 0.05）（表4～5）。利用多因素Logistic回归模型向前逐步剔除法进行分析，最终确定体质弱、早产、病例接触史、居住环境差、个人卫生差5个为手足口病危险因素，其中，早产、病例接触史、居住环境差为儿童手足口病最主要的致病危险因素（表6）。

3 讨论

手足口病病原体是一种或多种肠道病毒，EV71和CoxA16是该病的主要病原体。手足口病具有传染性，传播途径主要包括分泌物传播、与患者密切接触等，主要发病部位为手、足、口腔部位，症状多为疱疹和溃疡，严重时可引起脑部和肺部等多种严重并发症，多发生于5岁以下儿童[14-15]。目前，手足口病因较高的致残率和致死率，已被列为丙类传染病。快速、精准、便捷的病原体诊断对于临床治疗尤为重要。患者咽喉部分分泌物和粪便中均可检出病毒，有研究表明，粪便因排出病毒时间可达3～5周，标本的病毒检出率高于咽拭子[16]，因此，本研究选取粪便进行病毒核酸检测。传统手足口病病原体检测方法，诸如病毒分离培养和血清学方法和普通RT-PCR方法，因其耗时长、易受污染等缺点在快速精准方面受到了限制，而荧光定量RT-PCR方法恰好克服了以上缺点，此外，本研究结果显示，该法还具有特异性强，灵敏度高，重复率好的优点，非常适合手足口病病原体的检测[17-20]。

本研究对200例粪便标本检测检出EV71和CoxA16阳性标本共计153例。普通组感染46例，重型组感染66例，危重型组感染41例。EV71阳性标本感染91例，CoxA16阳性标本共78例。从上述研究结果可知，EV71和CoxA16病毒是儿童手足口病的主要致病病毒，所占总感染数的76.50%。此外，感染EV71的患儿数量多于感染CoxA16，且重型组和危重型组的EV71感染检出率均显著高于普通组，而普通组CoxA16感染检出率仅高于危重型组，说明EV71病原体毒力更强，对患儿身体具有更大的破坏性，推测重型组和危重型组的严重临床症状可能是因感染EV71引起的。Logistic回归分析显示，在所有调查的影响因素中，体质弱、早产、病例接触史、居住环境差、个人卫生差5个为手足口病危险因素，其中，早产、病例接触史、居住环境差为儿童手足口病最主要的致病危险因素。因此，为了有效地预防儿童手足口病的发生，儿童监护人应给儿童提供一个干净卫生的居住环境，注意儿童膳食营养，合理引导儿童对自身个人卫生的整理，包括饭前便后要洗手、勤洗澡等，最重要的是，发现儿童身体不适，应及时去医院检查，如果感染手足口病病毒，应根据医生建议，采用最恰当的方式治疗，并做好隔离措施。

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（收稿日期：2017-01-03 本文编辑：李亚聪）