TIMP—4在膀胱癌及癌旁正常膀胱组织中的表达

董维平++严奉奇++李霞++许秀丽++袁建林++武国军

[摘要] 目的 探讨基质金属蛋白酶抑制剂-4（TIMP-4）在膀胱癌组织与癌旁组织中的表达及其临床意义。 方法 收集2015年6月～2016年9月西京医院泌尿外科152例膀胱尿路上皮癌患者手术标本的癌组织及其癌旁组织，利用免疫组织化学染色法分别对其进行染色，并在显微镜下观察组织切片染色情况，运用半定量法分析膀胱癌组织及癌旁组织中TIMP-4蛋白的表达情况。 结果 TIMP-4蛋白免疫反应物主要沉积于细胞质。膀胱癌组织与癌旁组织中TIMP-4蛋白染色阳性率分别为26.97%和84.21%，差异有统计学意义（P < 0.05）。低级别膀胱乳头状尿路上皮癌与高级别膀胱乳头状尿路上皮癌组织中TIMP-4蛋白染色阳性率分别为38.71%和18.89%，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 TIMP-4蛋白在膀胱癌组织内的表达较癌旁组织表达低，且其表达量与膀胱癌组织学分级相关。

[关键词] 基质金属蛋白酶抑制剂-4；膀胱尿路上皮癌；免疫组织化学染色

[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0077-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of mammalian tissue inhibitor of metalloproteinase-4 （TIMP-4） in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma and its clinical significance. Methods Surgical specimens of cancer tissues and normal tissue adjacent to carcinoma of 152 cases diagnosed as bladder urothelial cell carcinoma were collected from June 2015 to September 2016 in Department of Urology of Xijing Hospital. The immunohistochemical staining was performed and the semi-quantitative scoring system was used to evaluate the extent and intensity of the staining. The expression of mammalian TIMP-4 in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma were analyzed by using semi-quantitative method. Results Immunohistochemistry showed that TIMP-4 protein positive was staining in the cytoplasm of normal tissues and bladder carcinoma. The positive expression rate of TIMP-4 in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma was 26.97% and 84.21% respectively， with statistical difference （P < 0.05）. The positive expression rate of TIMP-4 in low-grade bladder papillary urothelial carcinoma and high-grade bladder papillary urothelial carcinoma was 38.71% and 18.89% respectively， with statistical difference （P < 0.05）. Conclusion TIMP-4 expression level in bladder urothelial cell carcinoma tissue is lower than that in normal tissue adjacent to carcinoma. The expression degree in bladder urothelial cell carcinoma is associated with histopathologic grade.

[Key words] Mammalian tissue inhibitor of metalloproteinase-4； Bladder urothelial cell carcinoma； Immunohistochemistry

膀胱癌是泌尿系統发病率最高的恶性病变，其主要组织细胞学来源为尿路上皮细胞，常被称为膀胱尿路上皮癌（BUCC）或移行细胞癌（TCC），占到膀胱癌的90%以上。膀胱癌显著特点是肿瘤具有多发病灶和术后高复发率。近年来膀胱癌发病率、复发率、死亡率均呈逐年增加的趋势，应引起高度重视[1]。膀胱癌具有多中心、易复发、易侵袭、易耐药等生物学特性，10%～30%的非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）进展为肌层浸润性肿瘤，高级别的NMIBC更容易恶化，将近75%的高级别NMIBC在诊断后10年内复发、进展或死亡[2]，而对于膀胱癌复发及转移、浸润的机制研究仍不明确。组织基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）是体内细胞分泌的一类蛋白酶抑制剂，它们可以与基质金属蛋白酶原结合，并抑制其激活，进而影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡等过程[3]。TIMP-4是TIMP家族新发现的一个成员，其在宫颈癌、肝癌、胃癌等肿瘤内发现异常表达现象，并提示该蛋白与肿瘤的迁移、侵袭等生物学行为密切相关[4-6]。然而，关于TIMP-4在膀胱癌内的表达情况及其表达与膀胱癌的临床关系还未见报道，本实验拟通过免疫组织化学染色方法检测TIMP-4蛋白在膀胱癌组织与癌旁组织内的表达情况，并分析其表达与膀胱癌不同组织学分级的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2015年6月～2016年9月于第四军医大学西京医院泌尿外科手术治疗的患者152例，均为经尿道膀胱肿瘤电切手术治疗的非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌，获取肿瘤组织病理标本和癌旁正常膀胱组织标本，年龄51～72岁。根据WHO 2004非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌分级方法，其中组织学分级为低级别乳头状尿路上皮癌62例，高级别乳头状尿路上皮癌90例，均为初诊初治，无术前抗肿瘤史。152例患者的肿瘤标本作为实验组，癌旁正常膀胱组织作为对照组。实验中所使用的所有人体组织标本均经过第四军医大学第一附属医院药物临床试验伦理委员会审查。

1.2 主要試剂

兔抗TIMP-4多克隆抗体（美国Sigma公司）；免疫组化试剂盒；生物素标记的羊抗兔抗体；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥公司）。

1.3 实验方法

免疫组织化学SP法：制作石蜡切片，选片。组织切片烤箱内烘烤30 min；用二甲苯浸泡脱蜡3次。自100%到70%梯度浓度的乙醇溶液依次浸泡5 min，用PBS洗片3 min×3次。灭酶活性：用0.3%甲醇-H2O2进行内源性过氧化物酶灭活，用PBS洗片3 min×3次。抗原修复：切片用浓度0.01 mol/L、pH 6.0的枸橼酸缓冲液煮沸10 min，自然冷却后多次用PBS洗片3 min×3次。血清封闭：室温环境下覆加正常山羊血清封片20 min。抗体封闭：滴加适当浓度的TIMP-4一抗，4℃冰箱中过夜，PBS洗片3 min×5次。滴加稀释后的二抗（生物素标记的羊抗兔抗体），37℃孵育1 h，PBS洗片3 min×5次。SP封闭：室温滴加SP液孵育1 h，PBS洗片3 min×5次。后期处理：滴加临时配制的3，3-二氨基联苯胺四盐盐酸（DAB）显色液，约5 min观察显色程度，适时用PBS洗片；苏木素液染核后用乙醇70%～100%的浓度梯度依次脱水；二甲苯浸泡性切片透明处理；37℃烤箱干燥封片；电子显微镜下拍片保存。

1.4 评定标准

TIMP-4蛋白阳性染色主要表现为细胞质中棕黄色颗粒沉着。每例标本选取6个典型视野进行采集（10×40），计数染色细胞，用半定量分析法进行分析。按染色程度划分：无染色（0分）；浅染色（1分）；中等染色（2分）；浓染色（3分）。按染色细胞比例划分：<10%（0分）；11%～25%（1分）；26%～50%（2分）；51%～75%（3分）；>75%（4分）。最终阳性染色分值为染色程度分值与染色细胞百分比的乘积，共分为阴性（-）、弱阳性（+）、阳性（++）、强阳性（+++）四个层次，分别对应：0～1分、2～4分、5～8分和9～12分。“阳性表达率”计算公式为[（+）+（++）+（+++）]例数/总例数×100%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TIMP-4蛋白在膀胱癌组织及癌旁正常膀胱组织中的表达

实验组和对照组标本中TIMP-4蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P < 0.05），即TIMP-4蛋白在癌旁正常膀胱组织中的阳性表达率高于膀胱癌组织（图1、表1）。

2.2 膀胱癌不同组织学分级中TIMP-4蛋白的表达

膀胱癌不同组织学分级中TIMP-4蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P < 0.05），TIMP-4蛋白的阳性表达率在高级别乳头状尿路上皮癌中低于低级别乳头状尿路上皮癌（图2、表2）。

3 讨论

膀胱癌的发病率居全身恶性肿瘤的第九位，全球范围内每年新发病例达38万例，而死亡病例高达15万例[7]。在我国，膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占泌尿系恶性肿瘤的首位。男性膀胱癌发病率位居全身恶性肿瘤的第七位，女性排在第十位以后[8]。膀胱癌的预后与肿瘤的分级密切相关，其中绝大多数膀胱癌患者预后不良主要由于膀胱癌的转移，膀胱癌诊治后5年内复发风险变化从31%到78%，进展风险变化从0.8%到45%[9]。然而肿瘤的转移过程是一个多因素、多条件影响的复杂过程[10]。其中迁移、侵袭在肿瘤细胞的转移过程中至关重要，然而肿瘤细胞迁移、侵袭也是在多因素、多基因共同作用下完成的[11]，因此对影响肿瘤细胞迁移、侵袭的基因研究显得尤为重要。

研究显示，MMPs家族在肿瘤细胞的发展和侵袭过程中扮演着重要的角色[12]。MMPs是一类活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，能有效降解基底膜和细胞外基质的主要成分，并且在破坏组织结构的同时能促进肿瘤组织血管的形成[13]。而TIMP是抑制MMPs家族的一种重要酶类，在影响肿瘤细胞生长、侵袭等过程中起重要作用[14]。在正常情况下，MMPs与TIMP家族之间处于动态平衡状态，研究显示，当肿瘤细胞内的TIMP与MMPs失去平衡，TIMP影响肿瘤细胞的侵袭与转移[15]。目前已经发现，TIMPs家族成员有4个（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4）。TIMP-4是Greene等[16]在1996年采用已表达序列标志（EST）测定方法研究MMP抑制物TIMP时发现，属于TIMP家族成员的一种，按照发现顺序被命名为TIMP-4。TIMP-4其分子量为22 kD，含有224个氨基酸，具有其他TIMPs的主要特征。作为TIMP家族新发现成员，通过免疫组化、RT-PCR及原位杂交技术等方法研究发现，其在宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌等多种肿瘤组织内低表达[17-19]。

研究发现，TIMPs作为MMP特异性抑制因子，抑制MMP对细胞外基质（ECM）的降解，从而抑制肿瘤细胞的迁移侵袭。Kim等[20]研究发现，TIMP-1、TIMP-2能够抑制血管生成素诱导的血管内皮细胞出芽，说明TIMPs在抑制肿瘤新生血管形成中起重要作用。TIMP是一组抑制MMPs活性的低分子蛋白酶类，目前虽然关于TIMP的作用机制研究还不多，但是现有研究表明，TIMP-4可以抑制多种MMP的活性，包括MMP-2、MMP-9和MMP-1等，通过促进多种MMP蛋白的降解而抑制细胞的迁移侵袭[21]。然而关于TIMP-4在膀胱癌内的表达情况还没有相关文献报道，本实验通过免疫组织化学染色方法对膀胱癌组织及癌旁组织标本进行TIMP-4蛋白表达检测，发现TIMP-4染色阳性率在膀胱癌组织与癌旁组织中分别为26.97%和84.21%，且差异有统计学意义（P < 0.05），说明在膀胱癌组织内的阳性表达明显低于其在癌旁组织内的表达。进一步通过对不同组织学分级的膀胱癌组织染色分级统计发现，TIMP-4蛋白表达水平与膀胱癌的组织学分级密切相关，其在高级别乳头状尿路上皮癌和低级别乳头状尿路上皮癌中的阳性表达率分别为18.89%和38.71%，差异有统计学意义（P < 0.05），说明TIMP-4蛋白的表达水平与膀胱癌的恶性程度密切相关。

綜上所述，TIMP-4作为一种抑癌基因，其在多种系统肿瘤中基因表达缺失，与肿瘤细胞的发生、进展、迁移侵袭有密切联系。本研究揭示了TIMP-4蛋白在膀胱癌内低表达，且与膀胱癌的组织学分级密切相关，为对膀胱癌发生、发展的机制研究提供了新思路，同时也为TIMP-4在膀胱癌内作用机制的研究奠定了基础。

[参考文献]

[1] 黄健，林天歆，李锴文，等.中国膀胱癌诊断和治疗现状调查及初步分析[J].中华泌尿外科杂志，2014，35（2）：8-9.

[2] Chamie K，Litwin MS，Basestt JC，et al. Recurrence of high-risk bladder cancer：a population-based analysis [J]. Cancer，2013，119（17）：3219-3227.

[3] Somigliana E，Vigano P，Benaglia L，et al. Adhesion prevention in endometriosis：a neglected critical challenge [J]. J Minim Invasive Gynecol，2012，19（4）：415-421.

[4] Lizarraga F，Espinosa M，Ceballos-Cancino G，et al. Tissue inhibitor of metallo proteinases-4 （TIMP-4） regulates stemness in cervical cancer cells [J]. Mol Carcinog，2016，55（12）：1952-1961.

[5] Tsai HT，Hsieh MJ，Chiou HL，et al. TIMP-3-1296 T>C and TIMP-4-55 T>C gene polymorphisms play a role in the susceptibility of hepatocellular carcinoma among women [J]. Tumour Biol，2014，35（9）：8999-9007.

[6] Pullen NA，Anand M，Cooper PS，et al. Matrix metalloproteinase-1 expression enhances tumorigenicity as well as tumor-related angiogenesis and is inversely associated with TIMP-4 expression in a model of glioblastoma [J]. J Neurooncol，2012，106（3）：461-471.

[7] Ferlay J，Bray F，Center MM，et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008 [J]. Int J Cancer，2010，12（7）：2893-2917.

[8] Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics 2008 [J]. CA Cancer J Clin，2011，61（8）：69-90.

[9] Sylvester RJ，van der Meijden APM，Oosterlinck W，et al. Predicting recurrence and progression in individual patients with Stage Ta T1 bladder cancer using EORTC risk tables：a combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials [J]. Eur Urol，2006，49（2）：466-477.

[10] Desouza K，Chowdhu S，Hughes S. Prompt diagnosis key in bladder cancer [J]. Practitioner，2014，258（1767）：23-27.

[11] Xiong Z，Lu MH，Fan YH，et al. Downregulati0n of heparanase by RNA interference inhibits invasion and tumorigenesis of hepatocellular cancer cells in vitro and in vivo [J]. Int J Oncol，2012，40（5）：1601-1609.

[12] Nelson AR，Fingleton B，Rothenberg ML，et al. Matrix metalloproteinases：biologic activity and clinical implications [J]. J Clin Oncol，2000，18（3）：1135-1149.

[13] Sandhu BS，Sanyal AJ. Management of ascites in cirrhosis [J]. Clin Liver Dis，2005，9（4）：715-732.

[14] Chirco R，Liu XW，Jung KK，et al. Novel functions of TIMPs in cell signaling [J]. Cancer Metastasis Rev，2006，25（1）：99-113.

[15] Van Waveren C，Sun Y，Cheung HS，et al. Oxidative phosphorylation dysfunction modulates expression of extracellular matrix remodeling genes and invasion [J]. Carcinogenesis，2006，27（3）：409-418.

[16] Greene J，Wang M，Liu YE，et al. Molecular cloning and characterization of human tissue inhibitor of metalloproteinase-4 [J]. J Biol Chem，1996，271（48）：30375-30380.

[17] Lizarraga F，Espinosa M，Maldonado V，et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases-4 is expressed in cervical cancer patients [J]. Anticancer Res，2005，5（1B）：623-627.

[18] Bister V，Skoog T，Virolainen S，et al. Increased expression of matrix metalloproteinases-21 and -26 and TIMP-4 in pancreatic adenocarcinoma [J]. Mod Pathol，2007，20（11）：1128-1140.

[19] Lee S，Desai KK，Iczkowski KA，et al. Coordinated peak expression of MMP-26 and TIMP-4 in preinvasive human prostate tumor [J]. Cell Res，2006，16（9）：750-758.

[20] Kim I，Kim HG，Moon SO，et al. Angiopoietin-1 induces endothelial cell Sprouting through the activation of focal adhesion kinase and plasmin secretion [J]. Cite Res，2000，86（9）：952-959.

[21] Liu YE，Wang M，Greene J，et al. Preparation and characterization of recombination TIMP-4 [J]. J Biol Chem，1997，272（6）：20479-20483.

（收稿日期：2017-01-02 本文編辑：李亚聪）