人诺如病毒最新研究进展

刘波++刘红旗

[摘要] 人诺如病毒是导致人类非细菌性急性胃肠炎的主要原因，近年来其导致的发病率和致死率都在不断升高。人诺如病毒分子进化快、人群感染后持续排毒、低剂量感染及传播途径多样性等原因使得诺如病毒流行较为严重。然而，目前仍没有合适的动物模型以及有效的疫苗。本文主要介绍人诺如病毒的分子生物学特性、流行病学、分离培养、动物模型、检测技术及疫苗研发等方面的研究进展。

[关键词] 诺如病毒；流行病学；分离培养；动物模型；检测技术；疫苗

[中图分类号] R37 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0060-05

[Abstract] Human noroviruses are the major cause of the human acute non-bacterial gastroenteritis and increasingly leads to higher morbidity and mortality. Human noroviruses are characteristic of fast molecular evolution，continuous viral shedding， lower dose of infection and the diverse routes of transmission， which is considered to make norovirus epidemics even more serious. However， there are still no suitable animal model or effective vaccine. This review mainly introduces recent advances in fields of the epidemiology， viral isolation and cultivation， animal model， detection and vaccine development of Human noroviruses.

[Key words] Norovirus； Epidemiology； Isolation and culture； Animal models； Detection； Vaccine

人诺如病毒是导致人类非细菌性急性胃肠炎的主要病原体，是近年来导致由腹泻引起的发病率和死亡率增高的主要原因，据统计超过85%的非细菌性胃肠炎暴发是由诺如病毒引起[1]。诺如病毒首先由美国学者Kapikian等[2]于1972年报道，研究者采用免疫电镜方法从1968年在美国俄亥俄州诺沃克地区的一所学校暴发的胃肠炎病人粪便中检出，并根据其发现地命名为诺瓦克样病毒。随后在全球各地均有报道称从腹泻病人粪便中检测出此病毒。2002年8月，在第十二届国际病毒会议上被正式命名为诺如病毒。在国内，自方肇寅等[3]学者首次报道诺如病毒后，我国的相关研究也日益增多，然而主要集中在病情报道和检测技术研究等方面[4-7]。本文主要概述诺如病毒的生物学特性、流行病学、分离培养、动物模型、检测技术和疫苗研发情况。

1 人诺如病毒的生物学特性

诺如病毒属于杯状病毒科诺瓦克病毒属，直径为26～35 nm，无包膜，球形，呈二十面体对称，基因组为单股正链RNA，全长约为7.5 kb，包含3个开放阅读框，其中第一个阅读框（ORF1）长约5 kb，编码非结构蛋白，经翻译后修饰成6个功能蛋白，它们在病毒基因组复制和转录过程中发挥作用，分别为：N末端蛋白（p48）、NTPase、3A样蛋白（p22）、VPg（病毒基因组连接蛋白）、3 C样蛋白（3CL）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），其中RdRp所在的区域高度保守，常被作为诺如病毒诊断性PCR检测的扩增区域。第二个开放阅读框（ORF2）长约1.8 kb，编码530个左右氨基酸的衣壳蛋白（VP1），该蛋白经折叠形成两个结构域：壳结构域（S结构域）和突出结构域（P结构域）。S结构域形成VP1的内壳，P结构域突出在VP1结构的外围，包含P1和P2两个亚结构域，其中P2位于衣壳蛋白的最外层，易发生变异。因此，VP1 是组成病毒颗粒的主要蛋白，其P结构域决定了诺如病毒的抗原性。第三个开放阅读框（ORF3）长约0.6 kb，編码1个微小结构蛋白（VP2），其具体功能未知，有研究认为它可能参与病毒衣壳的构建，并有助于整个衣壳蛋白的稳定[8]。

诺如病毒根据其RNA多聚酶和衣壳蛋白序列同源性差异可分为6个基因组：GroupⅠ（GI）-Group Ⅵ（GVI）。其中，GⅠ、GⅡ、GⅣ主要感染人和非人类灵长类动物[9]，GⅢ主要感染牛和羊[10]，GV感染鼠[11]，GⅥ主要感染狗[12]。根据诺如病毒ORF2全基因序列相似性，GⅠ可进一步分为14个基因型，GⅡ可分为22个基因型。对编码病毒衣壳蛋白的VP1序列的分析研究表明，不同基因组间的差别在50%以上，而同一基因组的不同基因型间差异高达40%[13]。诺如病毒全基因组序列分析表明，不同基因组间的同源性为51%～56%，同一基因组不同基因型的同源性为69%～97%[14]。2014年以前绝大部分诺如病毒的暴发都与GⅡ.4变异株有关[15]，GⅡ.4的变异大约为10%[16]。

2 人诺如病毒的流行病学

诺如病毒是常见的非细菌性急性肠胃炎的主要病原，粪-口途径是主要传播方式，也可以通过污染的水源、食物及由病人的呕吐物或粪便形成的气溶胶等传播。易在医院、疗养院、学校、幼儿园、宾馆等人多密集、半封闭的环境中引起暴发性流行。诺如病毒感染的特征为突然发病，呕吐、腹痛和水样腹泻，可伴有发烧和头痛等，所有年龄人群对该病毒均敏感，一般潜伏期为24～48 h，病程为2～3 d，虽然常自愈，但不断出现的新流行株仍对人类健康造成很大威胁，尤其对儿童、老人及患者等免疫力低下人群。在北半球，每年的11月至次年4月是高发季节。诺如病毒除了像流感病毒一样具有季节性和缺少有效预防治疗手段外，更重要的是诺如病毒和流感病毒具有相似的分子进化和免疫逃逸的机制。

我国“突发公共卫生事件信息报告系统”上报的感染性腹泻暴发疫情数据显示，2006～2013年间我国人诺如病毒引起的腹泻暴发疫情报道数逐年上升，共报道56起疫情，发病4979例，平均每起暴发89例。2014～2015年中国多地区均报道暴发GⅡ.17基因型诺如病毒感染[6]，在国外尤其亚洲地区GⅡ.17基因型诺如病毒流行，表明诺如病毒流行株正逐渐由GⅡ.4基因型转变为GⅡ.17基因型。诺如病毒ORF2的基因同源性分析表明，GⅡ.17基因型诺如病毒株可分为3个不同的群氨基酸序列分析表明，衣壳蛋白表位A-E常发生不同程度变异，赋予了GⅡ.17基因型诺如病毒新的抗原特征。此外，负责结合组织血型抗原（HBGAs）的3个位点是常见的容易变异部位，表明了GⅡ.17基因型诺如病毒具有GⅡ.4基因型诺如病毒株变异快的特点[17]。

3 人诺如病毒的分离培养

病毒的分离培养是研究病毒致病机制和生产有效疫苗的前提。近50年来，学者们从未停止过对人诺如病毒的细胞培养研究。研究者们尝试了使用33种不同的细胞系培养人诺如病毒，然而都没有得到明显的效果[18]，近年来，三维细胞培养模型成为了培养人类诺如病毒的重点研究领域。Straub等[19]研究者将人胚胎小肠上皮细胞系INT-407通过3D培养后成功地复制了一株GⅡ型和一株GI型人诺如病毒。他们也将此模型应用于Caco-2细胞系，据报道称也能使诺如病毒进行复制[20]。然而，其他学者却没能重复出以上结果[21]。2014年，Jones等[22]报道用人类B细胞成功地复制了人诺如病毒，还指出肠道细菌包括HBGAs样分子对感染起到辅助作用。然而，该系统中病毒的复制效率很低，而且有较多的不确定因素。因此，最近的研究重点就转移到人肠道组织，这些组织多是由人类肠上皮干细胞分化而来，通过分离和培养后可以把它们构建成一个类似体内三维小肠上皮的功能单元，由整个绒毛隐窝轴和小肠上皮细胞内常见的表皮细胞类型组成[23]。美国诺如病毒研究中心Mary K. Estes实验室[24]于2016年7月报道，他们在荷兰Clevers博士等建立的人小肠肠道類细胞的基础上，摸索出了1个人诺如病毒培养系统，能有效地支持人诺如病毒的复制，而且还发现胆汁等添加剂可以使复制效率稍低的某些亚型人诺如病毒高效地复制。这一研究成果将极大地推动诺如病毒的基础研究和疫苗研发。然而，由于人的肠道组织来源有限，不可能应用于病毒大规模的培养和疫苗生产。因此，有必要找到一个能用于复制人诺如病毒的组织细胞培养系统或动物模型来替代人类肠道组织。

4 人诺如病毒感染的动物模型

动物模型对于疫苗和药物的研发十分重要，尤其是对于那些不能在体外进行细胞组织培养的病毒，如：人诺如病毒。科学家们对人类诺如病毒感染的动物模型研究从未间断。诺如病毒感染免疫功能正常的宿主很少引起严重的临床症状。因此，目前仍没有动物模型可以完全模仿人诺如病毒感染。Cheetham等[25]用GⅡ.4病毒株感染无菌猪，可引起轻度腹泻，且粪便中能检测到诺如病毒，病毒在某种程度上可以复制，并表现出特殊的免疫应答效应。另外，他们还发现不同的人类诺如病毒与无菌猪口腔表达的HBGAs及十二指肠组织的结合模式不同[26]。初生小牛可支持人类诺如病毒GⅡ.4基因型的感染[27]。人诺如病毒诺瓦克株通过静脉注射非人类灵长动物恒河猴后，也发现了感染的证据[28]。本研究团队最近从恒河猴中鉴定到与人GⅡ.17型诺如病毒具有高度同源性的病毒[29]。用含该病毒的粪便经口服途径攻击猴子后，虽然没有观察到明显的临床症状，但是可以在其粪便中检测到病毒核酸，从血清中也能检测到抗诺如病毒蛋白抗体。这首次表明了人诺如病毒可以自然感染非人类灵长类动物，为建立人诺如病毒感染的动物模型奠定了坚实的基础，对诺如病毒传播的预防和控制有着重要意义。

5 人诺如病毒的检测方法

诺如病毒的检测是诊断其感染和复制的唯一方法，主要可以通过如下3种方法来检测诺如病毒：

5.1 病毒颗粒检测方法

针对病毒颗粒常规的检测方法为电镜检测法，可分为直接电镜检测法和免疫电镜法。直接电镜法可以检测到直径30 nm左右的病毒颗粒，但要求病毒载量大。免疫电镜法利用标记的抗体通过表面抗原捕获病毒颗粒，然后进行电子显微镜观察，其检出率远远高于直接电镜法。电镜检测法是早期唯一的检测诺如病毒的方法[2]，它可以直观地观察到病毒颗粒，但其在电镜下形态学特征并不明显，因此检测结果并不准确可靠，使得感染病例无法确诊，且操作繁杂，灵敏度较低，不适合临床检测应用。

5.2 病毒核酸检测方法

核酸检测方法成为诺如病毒医学检验中的常用手段，主要包括多聚酶链反应技术（PCR）和核酸探针杂交技术。现有诺如病毒核酸检测方法的优缺点见表1。

5.3 病毒蛋白质检测方法

病毒蛋白检测方法主要是利用抗原抗体反应来实现对病原体的检测。该方法的灵敏度和特异性与抗原和抗体的亲和力有很大关系。目前较常用的诺如病毒免疫学检测方法包括：酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫层析技术等（表2）。

6 人诺如病毒疫苗研究

目前诺如病毒疫苗的研究主要集中在以下三方面：①利用昆虫细胞或真核系统表达诺如病毒的VP1蛋白可形成病毒样颗粒（VLP），其形状和免疫原性与天然诺如病毒相似[42-43]，能诱导较高的抗体反应，然而由于其生产工艺复杂和生产成本高，因此这类疫苗目前还只是处于研发阶段，难以推广应用；②诺如病毒的亚病毒颗粒具有一定的免疫原性，适用于研制亚单位疫苗，亚单位疫苗仅用病毒的主要表面蛋白质，避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副作用和疫苗引起的相关疾病，但它的不足之处是免疫原性较低，需与佐剂合用才能产生好的免疫效果。2016年本研究团队成功表达纯化了猴源诺如病毒亚病毒颗粒蛋白，与佐剂联合免疫小鼠后得到免疫原性较高的多抗，为亚单位疫苗研发奠定了基础[29]；③利用体外培养进行减毒疫苗或灭活疫苗的研发是最为理想的方法。

尽管对诺如病毒的研发越发深入，但目前还没有有效的诺如病毒疫苗，主要困难在于：①病毒遗传多样性，不同基因型间交叉反应低，人们对其感染和免疫学、进化机制方面了解不充分；②缺乏完善动物模型，使疫苗的有效性、安全性、稳定性及免疫力持续时间等评估难以全面开展；③体外培养不完善，使灭活疫苗或减毒疫苗研发困难。此外，计划免疫程序的复杂与紧张、疫苗的不良反应事件等因素阻碍了疫苗的研发和推广。然而，随着科学技术的进步、动物模型与体外培养的完善，相信未来可以研制出安全、有效的诺如病毒疫苗。

7 总结与展望

诺如病毒由于其传染性强，近年来在世界各地频繁暴发，引起了社会各界的极大关注。目前，对于人诺如病毒的基因组、蛋白结构以及人类免疫机制等方面已有了较全面的认识，但诺如病毒分子进化快、不能有效地培养和缺少合适动物模型等原因阻碍了人们对人诺如病毒的深入研究。然而，随着分子生物学技术的发展和对诺如病毒分子生物学认识的深入，以及诺如病毒体外培养系统和动物感染模型的逐步完善，相信一定能探索出一种有效预防和控制诺如病毒感染的策略。

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（收稿日期：2017-01-24 本文编辑：李岳泽）