微透析采样进行蛇床子软膏的皮肤局部药动学研究

周开++廖丰蕴+++王利胜+++余建烨

[摘要] 目的 建立蛇床子素在体皮肤微透析采样方法，研究蛇床子软膏在SD大鼠体内的局部药动学。 方法 采用浓差法考察浓度、流速对探针体外回收率的影响；减量法研究探针的体内回收率稳定性。SD大鼠植入皮肤探针后将蛇床子软膏涂敷于探针所在皮肤表面，测定微透析液中蛇床子素浓度，绘制药时曲线，计算药动学参数。 结果 随着灌流速度的增大，探针体外回收率有所下降，且回收率大小與蛇床子素的浓度无关；探针体内回收率为（44.29±1.28）%，体内12 h基本保持稳定；蛇床子软膏给药后，蛇床子素在皮肤组织内的透皮速率约为9.3402 μg/min，AUC0-t为8105.4 μg/（mL·min），平均滞留时间为979.8 min，能较长时间维持在较高水平。 结论 在体皮肤微透析法可用于蛇床子软膏局部药动学研究。

[关键词] 蛇床子软膏；皮肤微透析；局部药动学；经皮给药

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0021-05

[Abstract] Objective To establish a method of skin microdialysis technology in vivo in order to study the local pharmacokinetics of Fructus Cnidii Ointments in rats. Methods The effect of different flow rate and concentration on the probe recovery in vitro were investigated by gain and loss method. Recovery by loss was used to study the stability of the probe recovery in vivo. The Fructus Cnidii Ointments was applied to the skin surface where the skin probe was implanted. The osthole concentration of skin microdialysates was determined， the time curve of osthole concentration was drawn and pharmacokinetic parameters was calculated. Results The recovery of probe decreased as the follow rate increased and irrespective of osthole concentration； the recovery of skin probe in vivo was （44.29±1.28）% and basically stable within 12 hours； After Fructus Cnidii Ointments for transdermal administration， ostholepenetration rate in skin was 9.3402 μg/min， AUC0-t was 8105.4 μg/（mL·min）， and mean residence time was 979.8 min， which showed ostholecan maintain for a long time at a higher level. Conclusion Skin microdialysis can be used to study the pharmacokinetic of Fructus Cnidii Ointments.

[Key words] Fructus Cnidii Ointments； Skin microdialysis； Local pharmacokinetics； Transdermal drug delivery

蛇床子为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果实，具有解毒杀虫、燥湿祛风的功效，主要用于外治外阴湿疹、妇人阴痒、湿疹疥癣等[1]。蛇床子素是从蛇床子中提取的主要有效成分，具有抗菌、杀虫、抗炎镇痛等作用，尤适于外用治疗湿疹疥癣等皮肤病[2]。笔者在前期研究蛇床子软膏的制备及处方筛选的基础上[3-4]，进一步研究了蛇床子软膏中蛇床子素的体内皮肤局部药动学。虽然对蛇床子有效成分蛇床子素的体内过程及药代动力学有较多研究[5-8]，但外用经皮给药局部药动学尚未见国内外有相关文献报道。微透析技术是一种能够在保持皮肤完整结构状态下实现连续采样的技术，具有对皮肤破坏小的优点，已经被越来越多地应用到皮肤药动学研究[9-16]。本研究采用皮肤微透析技术对制备的蛇床子软膏进行局部药动学研究，为蛇床子软膏的应用提供依据。

1 仪器与材料

蛇床子素（批号110822-200305，中国药品生物制品检定所）；无水乙醇，天津市致远化学试剂有限公司；蛇床子软膏，广州中医药大学中药制剂实验室自制；乙腈，欧普森公司，色谱纯；蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

雄性SD大鼠，SPF级，体重（220±10）g，购于广州中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（粤）2013-0020，动物合格证号：44005900002581。

Waters高效液相色谱仪（515泵，2487紫外检测器，美国Waters公司）；N3000色谱工作站（浙江大学）；AMW120D十万分之一分析天平、ELB200电子天平（日本岛津）；微透析系统（美国BAS公司）包括：MD1001灌注器推进泵、MD0100灌注器、MD1002灌注器支架、MD1000流速控制器；线性探针（CMA 30 MD，膜长10 mm，分子截留量6000，瑞士CMA公司）。

2 方法与结果

2.1 蛇床子素分析方法的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（80∶20；检测波长：322 nm；流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取蛇床子素对照品20.3 mg，用30%乙醇生理盐水定容至100 mL，即得20.3 μg/mL蛇床子素对照品溶液。

2.1.3 专属性试验

取雄性SD大鼠，麻醉后植入微透析探针，用30%乙醇生理盐水作为灌流液灌流皮肤微透析探针，所得透析液即为空白微透析液。取在空白微透析液、蛇床子素对照品溶液及蛇床子素凝胶膏剂透析液按“2.1.1”项下方法进行液相分析，色谱图见图1。蛇床子软膏透析液中蛇床子素的保留时间与对照品溶液相符，空白微透析液无干扰，表明所建立的方法可用于蛇床子素的测定。

2.1.4 线性范围考察

将20.3 μg/mL蛇床子素对照品溶液用30%乙醇生理盐水配制成浓度分别为1.015、4.060、6.090、8.120、12.180、20.3 μg/mL系列浓度标准品溶液，过0.22 μm微孔滤膜后进样分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，拟合线性方程为Y = 13 496X+194.49（r = 0.9998）。结果表明，蛇床子素在质量浓度1.015～20.3 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

吸取20.3 μg/mL的对照品溶液连续重复进样6次，峰面积RSD值为1.09%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性实验

取蛇床子软膏微透析液样品10 μL，分别于1、2、4、8、12、24 h时间点进样，计算蛇床子素峰面积的RSD值为2.23%，表明蛇床子素微透析液在24 h内稳定。

2.1.7 加样回收率试验

采用空白加样法，取空白微透析液9份，每份1 mL，分别加入0.2、0.4、0.6 mL浓度为20.3 μg/mL蛇床子素对照品溶液，每个浓度3份，用30%乙醇生理盐水定容至2 mL，制成低、中、高浓度分别为2.03、4.06、6.09 μg/mL的系列溶液，分别进样测定，计算回收率，其中低中高浓度的平均回收率分别100.04%、99.50%、99.86%，RSD分别为1.11%、0.98%、0.38%。

2.2 探针体外回收率试验

2.2.1 流速对回收率的影响

2.2.1.1 增量法考察流速对回收率的影响 将微透析探针浸于20.3 μg/mL（ρECF）的蛇床子素含药灌流液中，利用30%乙醇生理盐水溶液在不同流速（0.5、1、2、3、4 μL/min）下灌注探针。收集微透析样品30 μL，HPLC测定透析液中蛇床子素的含量（ρdialysate）。通过增量法计算蛇床子素的回收率：R= ρdialysate/ρECF×100%（公式1）。

2.2.1.2 减量法考察流速对回收率的影响 将探针浸入30%乙醇生理盐水溶液中，用20.3 μg/mL的含药灌流液灌注探针。收集样品测定其中的蛇床子素的含量（ρdialysate）。流速与增量法中所用的相同。通过减量法计算蛇床子素的回收率：D=（ρperfμsate-ρdialysate）/ρperfμsate×100%（公式2），增量法和减量法测定流速对蛇床子素回收率的影响，结果表明，蛇床子素探针回收率随流速增大呈下降趋势，各种流速下增量法及减量法测得的回收率基本一致，提示反透析法可用于测定蛇床子素体内回收率。见图2。

2.2.2 浓度对回收率的影响

2.2.2.1 增量法考察浓度对回收率的影响 将探针依次浸入在6种不同浓度（3.5、9.5、11.4、15.9、18.7、20.3 μg/mL）的蛇床子素溶液中，用30%乙醇生理盐水溶液以1 μL/min的流速灌注探针；收集并测定透析液中的蛇床子素浓度。按增量法公式1计算蛇床子素的回收率。

2.2.2.2 减量法考察浓度对回收率的影响 将探针依次浸入到30%乙醇生理盐水溶液中，用6种不同浓度蛇床子素溶液以1 μL/min的流速灌注探针；收集并测定透析液中的蛇床子素浓度。按减量法公式2计算蛇床子素的回收率，增量法和减量法测定浓度对回收率，结果表明，在6种不同浓度的透析媒介中，蛇床子素皮肤探针所得回收率和传递率都很接近。表明蛇床子素在3.5～20.3 μg/mL浓度范围内，探针的回收率和传递率与浓度无关。见图3。

2.3 蛇床子软膏的体内局部药动学研究

2.3.1 植入探针

參考文献[17]方法，将SD大鼠10%水合氯醛麻醉后，剪去腹部皮毛，6%硫化钠脱毛，48 h后选取皮肤无损伤大鼠，20%乌拉坦腹腔注射麻醉后仰卧位固定于加热垫上，将线性微透析探针小心植入皮下组织。

2.3.2 探针体内回收率稳定性考察

按“2.3.1”项下方法植入皮肤探针后用30%乙醇生理盐水作为灌流液1 μL/min灌流皮肤微透析探针，平衡1 h后将灌流液换成含蛇床子素15.9 μg/mL的30%乙醇生理盐水溶液，1 μL/min持续灌流12 h，每隔30 min收集样品，并按色谱条件测定各样品中蛇床子素含量，按公式D=（ρperfμsate-ρdialysate）/ρperfμsate×100%计算各时间点蛇床子素探针回收率，结果表明，蛇床子素皮肤探针体内回收率为（44.29±1.28）%，12 h内保持稳定。见图4。

2.3.3 蛇床子软膏在体透皮吸收实验

在体透皮实验开展前2 d，剃除大鼠腹部皮毛，并用6%的Na2S进行彻底脱毛，恢复48 h后选择角质层未损伤大鼠进行实验。按“2.3.1”项下方法植入皮肤线性后，以1 μL/min的流速灌流生理盐水平衡1 h后收集30 min空白透析液，然后将2.0 g蛇床子软膏剂均匀涂抹在探针透析膜上方，同时开始收集透析液，每30分钟收集1管，连续收集15 h。取透析液20 μL测定透析液中的蛇床子素浓度，然后按体内探针D的结果校正，计算皮肤组织中的实际蛇床子素浓度（C = C透析液/D），以皮肤组织中的实际蛇床子素浓度对时间作图结果见图5。采用PKSolver 2.0软件进行非房室模型拟合，计算各药动学参数，软膏剂组t1/2为378 min，Tmax为681 min，Cmax为12.35 μg/mL，AUC0-t为8105.4 μg/（mL·min），AUMC0-∞为8326.3 μg/（mL·min），MRT0-t为979.8 min，CL为0.189 μg/（mL·min）。

另将30 μL作为取样量计算相对累积吸收量，并绘制累积吸收量对时间曲线图（图6），得出相关曲线为Y = 9.3402X -1265.2，r = 0.9866。可以看出，蛇床子素软膏剂中蛇床子素Q-t基本呈零级吸收，蛇床子素的透皮速率约为9.3402 μg/min。

3 讨论

微透析探针灌流液主要为水性灌流液，其组成、pH值、渗透压、离子强度与采样部位的内环境越接近越好。因灌流液水性组成的特性，故比较适宜于极性成分的采样[18-19]。蛇床子素在生理盐水中水溶性较差，故有必要采取措施在尽量少影响内环境的前提下，增加其在灌流液中的溶解度，实验中发现蛇床子素在30%乙醇生理盐水中溶解度较好，满足漏槽条件，因此实验中最终选择30%乙醇生理盐水作为灌流液。

性能较好的经皮给药制剂应能使药物较快地被吸收进入皮下组织形成贮库，持久地发挥药效作用。本研究中，蛇床子软膏组皮肤中平均滞留时间为979.8 min，AUC0-t为8105.4 μg/（mL·min），相比对照组释药更平稳且有一定的缓释作用，原因可能为蛇床子素包被于基质材料内，需先从基质材料中释放出来才能到达组织部位。蛇床子制成软膏剂给药后，蛇床子素在皮肤组织中的蓄留量能在较长时间保持较高水平，体现了经皮给药系统的优势。

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（收稿日期：2017-01-05 本文编辑：张瑜杰）