一株纤维素高产菌株的鉴定及发酵条件优化

葛含静，杨苗苗

（陕西学前师范学院生命科学与食品工程学院，陕西西安710100）

一株纤维素高产菌株的鉴定及发酵条件优化

葛含静，杨苗苗

（陕西学前师范学院生命科学与食品工程学院，陕西西安710100）

从实验室自制醋中筛选出1株纤维素高产菌株J2，经形态学特征及分子生物学鉴定，确定为汉森氏葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter hansenii，GenBank登录号为GU213109）。通过PB（Plackett-Burman）和BB（Box-Behnken）试验设计优化菌株J2的发酵培养条件，结果表明，培养基中酵母膏和无水乙醇的含量对BC（细菌纤维素，bacterial cellulose）产量影响极显著，ZnSO4的含量影响显著。通过多元二次方程方差分析及回归方程系数显著性检验，表明所建模型与实际拟合良好，且发酵培养基优化后配方中酵母膏3.3 g/L，ZnSO40.9 g/L，无水乙醇0.7%；使用优化后的发酵培养基，菌株J2的BC产量增加到10.41 g/100 mL，提高了22.18%。发酵动力学试验表明，菌株J2最佳发酵时间为7 d，BC产量可达12g/100mL。

细菌纤维素；鉴定；发酵条件

纤维素是地球上最丰富的大分子材料，它与人们的衣食住行息息相关。研究发现，自然界绝大部分纤维素由植物的光合作用产生，但某些微生物可通过异养作用产生胞外纤维素，即细菌纤维素（bacterial cel－lulose，BC）。BC仅由β-1，4-D-吡喃葡萄糖一种单体聚合而成，不掺杂其他任何形式的糖，故而其纯度极高[1-2]。与常见的植物纤维相比，BC机械强度高、吸水保水率高、生物适应性良好，是性能最好的纤维素，已广泛应用于食品、医药、造纸、声学器材、石油开采等许多领域[3]。

目前，BC的合成研究主要围绕培养设备的设计与改造、培养基及培养条件的优化、菌株的代谢工程改造、高产菌株的自然选育及诱变选育等展开。Hornung等[4-5]研制出一种内含喷雾装置的反应器，可把营养成分和氧气喷洒到BC表面，使BC产量大大提高。Hwang等[6]通过优化培养基溶氧浓度，使BC产量最高可达15 g/L（干重）。Carolina等[7]克隆了Ga.hansenii ATCC23769纤维素合成酶操纵子中的部分基因，并过表达这些基因以期提高BC产量。马承铸[8]和贾士儒[9]分别通过自然选育获得了BC高产菌株。余晓斌等[10]和杨甲平[11]分别通过紫外诱变和高静水压诱变方法实现了BC高产突变株的成功选育。尽管BC生物合成的研究在各个方面都取得了长足进展，但从源头上自然筛选出性能稳定的BC高产菌株、优化其发酵条件、表征所产BC性能指标，仍具有重要的研究意义。本研究对前期成功筛选的1株性能优良的BC高产菌株J2进行分类鉴定，然后优化了发酵培养基，使BC产量大大提高，为后续通过诱变或基因工程方法选育优良的BC产生菌株奠定了基础，也可为BC的工业化生产提供参考。

1 材料与设备

1.1 材料

荞麦醋：陕西学前师范学院生命科学与食品工程学院综合实验室自制。

1.2 试剂

细菌基因组提取试剂盒、DNA marker、Ex Taq酶：日本TakaRa公司；DNA胶纯化及回收试剂盒：美国Amersham Biosciences公司；细菌16S rRNA通用扩增引物F9/R1510及测序引物F9，R1510和F520[12]：上海生工（Sangon Biotech）合成；其它试剂均为分析级或生物级。

1.3 主要培养基

种子培养基配方：葡萄糖70 g/L，酵母膏10 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 15 g/L，无水乙醇2%。

基础发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 10 g/L，无水乙醇2%。

所有培养基均在121℃高压灭菌15 min后备用。

2 方法

2.1 菌种鉴定

形态学鉴定：取活化菌体，结晶紫染色，显微镜下观察菌体形态；同时，取活化菌体，接种于种子培养基平板，30℃恒温培养3 d～5 d，观察菌落形态。

分子生物学鉴定：提取BC产生菌基因组DNA，以之为模板，F9/R1510为引物扩增16S rRNA序列。扩增产物由上海生工测序。序列在国际核酸数据库（NCBI）中进行Blast同源性比对，用MEGA4绘制系统发育树，结合形态学特征确定其生物学地位。

2.2 发酵条件优化

Plackett-Burman（PB）试验设计：根据笔者前期单因素试验的结果，选取葡萄糖/蔗糖、酵母膏、FeSO4、ZnSO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、苹果酸和无水乙醇等8个因素为发酵生产BC的关键影响因素设计PB试验，因素水平及编码见表1。

表1 PB试验因素水平及编码Table 1Levels and code of variables for PB design

以所产BC湿重为评价指标，用Design Expert分析数据及建立模型。

Box-Behnken（BB）试验设计：选取PB试验确定的显著影响BC产量的因素，即酵母膏、ZnSO4、无水乙醇，为BB试验考察的变量，因素水平及编码见表2。

表2 BB试验因素水平及编码表Table 2Levels and code of variables for BB design

3 结果与讨论

3.1 菌种鉴定

菌株J2细胞形态（×1000）和菌落形态见图1。

图1 菌株J2细胞形态（×1000）和菌落形态Fig.1Cell shape and colony shape（×1000）of strain J2

形态学特征如图1，J2菌体细胞呈杆状，单个或成对，大小为（2.12 μm～4.18 μm）×（0.81 μm～0.92 μm）；菌落为圆形，不透明的乳白色，表面光滑但有凸起，大小为0.9 mm～1.4 mm。对照《微生物学试验》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步确定菌株J2为醋酸杆菌属。

菌株J2的16S rRNA基因凝胶电泳图见图2，菌株J2的系统发育树见图3。

图2 菌株J2的16S rRNA基因Fig.216S rRNA genes of strain J2

图3 菌株J2的系统发育树Fig.3Phylogenetic tree of strain J2

分子生物学鉴定如图2和图3，对菌株J2的16S rRNA序列进行扩增，测序后构建系统发育树，可知，菌株J2与菌株Ga.hansenii NBRC14817、Ga.hansenii NBRC14816和Ga.hansenii NBRC14820同枝，相似度达100%。此方法是通过分析生物的决定表型特征的遗传特征DNA或RNA进而得到生物的遗传相关性，故而更客观可信。因此，结合形态学特征，可以确定，菌株J2是汉森氏葡糖醋杆菌（Ga.hansenii）。

3.2 发酵条件优化

3.2.1 主要影响因素的筛选

3.2.1.1 PB试验

PB试验主效应分析见表3。

表3 PB试验主效应分析Table 3Analysis of the main effects for the PB design

由表3可知，在菌株J2发酵生产BC的所有影响因素中，酵母膏和无水乙醇对BC产量影响极显著，ZnSO4影响显著。因此，选择这3个因素作为菌株J2发酵生产BC的关键影响因素进行BB试验。

3.2.1.2 BB试验

BB试验设计方案及结果见表4。

表4 BB设计及BC产量Table 4BB design and yield of BC

多项式拟合可得BC产量Y对自变量无水乙醇x1、酵母膏x2、ZnSO4x3的回归方程为：Y=9.38+1.36x1+ 0.78x2-0.44-0.97-0.60-0.42x1x3。

发酵培养基多元二次方程方差分析见表5，发酵培养基回归方程系数显著性检验见表6。

表5 发酵培养基多元二次方程方差分析表Table 5Anova table for the regression equation of cultivation

表6 发酵培养基回归方程系数显著性检验Table 6Regression coefficients and significance of the cultivation

由表5可知，所建模型极显著，失拟项不显著，预测值与真实值高度相关，说明该模型与实际拟合良好，可用于菌株J2发酵生产BC的分析和预测。

由表6可知，在模型参数中，x1、x3、x12、x22对BC产量影响极显著，x32，以及x2和x3之间的交互作用对BC产量影响显著。对方程各自变量（x1、x2、x3）求极值，得到极值点为：x1=0.310，x2=-0.151，x3=1，即酵母膏3.3 g/L，ZnSO40.9 g/L，无水乙醇0.7%。在此最优条件下，预测BC的最大产量为9.12 g/100 mL。用预测的最优发酵培养基配方做验证试验，所得BC产量为10.41 g/100 mL，证明所建模型能够预见菌株J2的实际发酵情况。菌株J2的BC产量是优化前的（8.52 g/100 mL）1.22倍。

3.2.2 动力学曲线

菌株J2产BC动力学曲线见图4。

图4 菌株J2产BC动力学曲线Fig.4Kinetic curve of BC-producing of strain J2

由图4可知，菌株J2静态发酵2 d后，进入对数生长期，从第7天开始进入稳定期，此后BC产量增长缓慢。所以，最佳发酵时间可确定为7 d。

4 结论

本研究对前期筛选的BC高产菌株J2鉴定，确定为汉森氏葡糖醋杆菌（Ga.hansenii，GenBank登录号为GU213109）。通过PB和BB试验设计优化菌株J2的发酵培养条件，结果表明，培养基中酵母膏和无水乙醇的含量对BC产量影响极显著，ZnSO4的含量影响显著；BC产量Y对自变量无水乙醇x1、酵母膏x2、ZnSO4x3的回归方程为Y=9.38+1.36x1+0.78x2-0.44x12-0.97x22-0.60x32-0.42x1x3。通过发酵培养基多元二次方程方差分析及回归方程系数显著性检验，表明所建模型与实际拟合良好，且发酵培养基优化后配方中酵母膏3.3 g/L，ZnSO40.9 g/L，无水乙醇0.7%；使用优化后的发酵培养基，菌株J2的BC产量增加到10.41 g/100 mL，提高了22.18%；发酵动力学试验表明，菌株J2最佳发酵时间为7 d，此时，BC产量约达12 g/100 mL。

[1]IGUCHI M,YAMANAKA S,BUDHIONO A.Review Bacterial cellulose-a masterpiece of nature’s arts[J].Journal of Materials Science, 2000,35：261-270

[2]PARK J K,KHAN T,JUNG J Y.Structural studies of the glucuronic acid oligomers produced by Gluconacetobacter hansenii strain[J]. Carbohydrate Polymers,2006,63：482-486

[3]咸赫,史素娟,毛静静,等.一株细菌纤维素生产菌株Gluconacetobacter xylinus的分离鉴定及其产物分析[J].纤维素科学与技术, 2016,24(2)：77-84

[4]HORNUNG M,LUDWIG M,GERRARD A M,et al.Optimizing the production of bacterial cellulose in surface culture：Evaluation of product movement influences on the bioreaction(Part 2)[J].Engineering in Life Sciences,2006,6(6)：546-551

[5]HORNUNG M,LUDWIG M,SCHMAUDER H P.Optimizing the productin of bacterial cellulose in surface culture：A novel aerosol bioreactor working on a fed batch principle(Part 3)[J].Engineering in Life Sciences,2007,7(1)：35-41

[6]HWANG J W,YANG Y K,HWANG J K,et al.Effects of pH and dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 in agitated culture[J].Journal of Bioscience&Bioengineering, 1999,88(2)：183-188

[7]MELO C V D,SOUZA-MOREIRA T,VALENTINI S R,et al. Cloning of upstream region and cellulose synthase operon genes involved in bacterial cellulose biosynthesis by Gluconacetobacter hansenii ATCC23769[J].BMC Proceedings,2014,8(4)：176

[8]马承铸,顾真荣.醋菌纤维素高产菌株筛选和菌物鉴定[J].上海农业学报,2000,16(3)：78-82

[9]贾士儒,傅强,张恺瑞,等.葡萄糖氧化杆菌发酵生产细菌纤维素的方法：99109800[P].2001-01-24

[10]余晓斌,卞玉荣,全文海,等.细菌纤维素高产菌的选育[J].纤维素科学与技术,1999,7(4)：63-66

[11]杨甲平.细菌纤维素高产菌株超高压诱变选育及冻干保藏研究[D].杨凌：西北农林科技大学,2009

[12]TAKAHASHI M,YUKPHAN P,YAMADA Y,et al.Intrageneric structure of the genus Gluconobacter analyzed by the 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences[J].Journal of General Appllied Microbiology,2006,52(3)：187-193

[13]唐丽杰．微生物学试验[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社, 2004：89-91

[14]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社, 1999：135-137

Identification and Fermentation Conditions Optimizing of A High-yield Bacterial Cellulose-producing Strain

GE Han-jing，YANG Miao-miao
（College of Life Science and Food Engineering，Shaanxi Xueqian Normal University，Xi'an 710100，Shaanxi，China）

A high-yield bacterial cellulose（BC）-producing strain named J2 was isolated from lab homemade vinegar.It was identified as Gluconacetobacter hansenii（GenBank accession GU213109）by morphological characteristics and molecular biological identification.Additionally，the fermentation conditions of strain J2 were studied by PB and BB experiments.The results showed that the contents of yeast extract and anhydrous alcohol had extremely significant influence on BC yield.Moreover，the data of regression equation of cultivation and regression coefficients and significance of the cultivation indicated that the established model agreed well with the practice，and the optimum fermentation medium contained yeast extract 3.3 g/L，ZnSO40.9 g/L and anhydrous alcohol 0.7%.Under the optimum fermentation conditions，BC yield could reach to 10.41 g/100 mL，which increased by 22.18%.Finally，the results of fermenting kinetic experiment showed that the optimum fermentation time was 7 d，and BC yield was about 12 g/100 mL at this time.

bacterial cellulose；identification；fermentation conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.038

2016-08-08

陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目（2016JQ3036）；陕西省教育厅产业化培育项目（2012JC03）；陕西省科技厅农业科技创新与攻关项目（2016NY-204）；陕西省教育厅科学研究项目（15JK1183）

葛含静（1981—），女（汉），讲师，博士研究生，研究方向：粮食加工与发酵技术创新。