生物酶法提取黄秋葵果实黄酮工艺优化研究

王维婷，曹宏杰，郭溆，程安玮，刘超，孙金月，*

（1.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100；2.山东省农产品精深加工技术重点实验室，山东济南250100；3.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

生物酶法提取黄秋葵果实黄酮工艺优化研究

王维婷1，2，曹宏杰3，郭溆1，2，程安玮1，2，刘超1，2，孙金月1，2，*

（1.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100；2.山东省农产品精深加工技术重点实验室，山东济南250100；3.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

为优化黄秋葵果实黄酮的提取工艺，以黄秋葵果实为原料，采用生物酶（纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶）法提取黄秋葵果实黄酮，探讨酶添加量、酶解温度、料水比、酶解时间、缓冲液pH值对黄酮得率的影响。在单因素试验的基础上，设计正交试验对黄秋葵果实中黄酮的提取工艺条件进行优化；最优条件下，纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶提取黄秋葵果实黄酮最高含量分别为：70.385、64.522、62.167mg/g。

黄秋葵；黄酮；果胶酶；纤维素酶；木瓜蛋白酶

黄秋葵原产自非洲的埃塞俄比亚一带，因为其果实脂肪含量低、热量低、营养丰富[1-2]，在欧美地区早已将黄秋葵作为运动员的食用蔬菜及老年人的保健蔬菜品种之一，因其外形像羊角一样故又称为羊角豆。近年来，在日本、中国十分流行，黄秋葵所具有的抗疲劳、健胃助消化、提高免疫力等功效也逐渐被人们所认识[3-5]。我国自70世纪90年代从印度引入黄秋葵开始种植[3]，由于气候土壤合适，在湖南、湖北、江苏、山东等地广泛种植，已成为我国出口新兴保健蔬菜的重要品种之一。黄酮作为黄秋葵嫩果中重要的活性物质，具有抗氧化性、抗炎、抗衰老、抗癌等作用[6-8]，也渐渐地被深入研究，目前关于黄秋葵果实黄酮的研究比较少，具有很好的研究应用前景。

黄酮作为与秋葵功效有直接关系的一种活性物质，具有很好的药用价值，而目前关于黄秋葵的活性物质的研究主要集中于不同活性成分的分析上，对于如何从黄秋葵果实中最大效率的提取黄酮的工艺研究还比较少。本研究通过优化黄秋葵果实中黄酮的提取技术，为分析其黄酮的含量、评价黄秋葵果实黄酮的营养品质提供技术支持，为黄秋葵深入的开发提供理论和数据参考，具有明显的应用前景与科学意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄秋葵（取自山东省农业科学院农产品研究所章丘龙山试验基地），品种为早生五角。将采摘下的黄秋葵果实清洗干净切片，-25℃冻存。将冷冻的秋葵片在冷冻干燥机中冷冻干燥后，磨粉置于干燥皿中保存。

无水乙醇（分析纯）：天津富宇化工；三水合柠檬酸三钠、氢氧化钠、盐酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝（分析纯）：西陇化工股份有限公司；纤维素酶（400 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、果胶酶（500 U/mg）：源叶生物公司。

XMTE-8112恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；6202小型高速粉碎机：台湾兴实利和公司；UV-1800紫外可见分光光度计：日本岛津国际贸易有限公司；UPW-20N超纯水器：北京市历元电子仪器公司；LXJ-IIB离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

采用生物酶（果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶）法提取黄秋葵果实黄酮，探讨酶添加量、提取温度、料水比、酶解时间、缓冲液pH值对黄酮得率的影响。

取黄秋葵果实粉末1 g于试管中，加入一定量的生物酶（果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶）及缓冲溶液，在不同的温度下恒温水浴。一定时间后于100℃下灭酶处理，冷却至室温。加入与缓冲溶液等体积的80%的乙醇溶液在50℃下浸提120 min，将溶液倒入25 mL离心管中在4 000 r/min下离心10 min。取10 mL上清液于25 mL容量瓶中，加入0.7 mL的5%的亚硝酸钠溶液，充分混匀后静置6 min；加入0.7 mL的10%硝酸铝溶液，混匀后静置6 min；加入4%的氢氧化钠溶液5 mL后，用80%的乙醇定容至刻度线，室温下放置15 min。充分反应后倒入10 mL离心管中在3 500 r/min下离心5 min，取上清液在510 nm处比色测量吸光度。

标准曲线绘制及黄酮得率的计算采用李加兴等的超声辅助提取工艺[9]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 缓冲液pH值对黄酮提取的影响

根据不同酶的特点选定缓冲液pH值做单因素试验，在其他因素不变的条件下考察该因素对黄秋葵果实中黄酮得率的影响。固定提取温度为50℃，酶添加量3%，酶解时间90 min，料水比为1∶30（g/mL）。缓冲液pH值对酶提取黄秋葵黄酮得率影响见图1。

图1 缓冲液pH值对黄秋葵黄酮得率的影响曲线图Fig.1The effect of buffer pH influence on okra flavonoids yield

由图1可以看出，随着pH值的增大，纤维素酶的黄酮提取效率先上升后降低，在pH 4.0时达到峰值32.739 mg/g，随后下降；果胶酶的黄酮得率峰值出现在pH 3.5时，为31.645 mg/g，而木瓜蛋白酶的峰值为pH 5.0，黄酮得率为35.934 mg/g。酶在最适反应pH条件下能够最大活力，使得黄秋葵果实中的黄酮加快溶出。

2.1.2 酶解时间对黄酮提取的影响

根据不同酶的特点进行酶解时间单因素试验，考察该因素对黄秋葵果实中黄酮得率的影响。根据不同酶的特点选择其最适pH值：纤维素酶4.0、果胶酶pH值为3.5、木瓜蛋白酶5.0；固定提取温度为50℃，酶添加量3%，料水比为1∶30（g/mL）。缓冲液pH值对酶提取黄秋葵黄酮得率影响见图2。

从图2可以看出，随着时间的延长，黄酮的得率也不断的上升，酶活力得到充分的利用，酶解反应比较完全，果胶酶和蛋白酶在120 min时酶解效果最充分，提取黄酮得率分别为45.665、38.670 mg/g，纤维素酶在150 min时酶解效果最好，提取黄酮得率为43.082mg/g。果胶酶的提取效果最佳，其次为纤维素酶和蛋白酶。

图2 酶解时间对黄秋葵黄酮得率的影响Fig.2The influence of extraction time of okra flavonoid yield

2.1.3 酶添加量对黄酮得率的影响

选定酶的添加量（1%～6%）做单因素试验，在其他因素不变的条件下考察该因素对黄秋葵果实中黄酮得率的影响。根据不同酶的特点选择其最适pH值：纤维素酶4.0、果胶酶3.5、木瓜蛋白酶5.0；提取时间纤维素酶150 min，果胶酶及木瓜蛋白酶120 min，固定提取温度为50℃，料水比为1∶30（g/mL）。酶添加量对黄秋葵黄酮得率影响见图3。

图3 不同酶添加量对黄秋葵黄酮得率的影响Fig.3Effect of different enzyme addition amount on okra flavonoid yield

由图3可以看出，纤维素酶、果胶酶及木瓜蛋白酶添加量在1%～4%范围内所提取的黄酮得率是逐渐增加的，超过4%后反而降低。这是因为底物的限制，此时如果继续加大酶量，底物浓度对酶不能饱和，使得酶作用受到抑制，从而导致黄酮的得率下降。选用高浓度的酶会造成资源的浪费，因此选择4%的酶添加量比较适宜，纤维素酶的酶解效果要好于果胶酶及蛋白酶，在酶添加量为4%的条件下，纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶提取的黄酮得率分别为54.322、45.537、39.117 mg/g。

2.1.4 料水比对黄酮提取的影响

选定料水比进行单因素试验，在其他因素不变的条件下考察该因素对黄秋葵果实中黄酮得率的影响。根据不同酶的特点选择其最适pH值及酶解时间；固定提取温度为50℃，酶添加量为4%。料水比对黄秋葵黄酮得率影响见图4。

图4 料水比对黄秋葵黄酮提取含量的影响Fig.4The influence of water ratio on okra flavonoid extract content

由图4可以看出，随着料水比增加，3种酶的黄酮提取得率先上升，纤维素酶对黄酮得率的影响在料水比1∶50（g/mL）时黄酮得率最高，蛋白酶及果胶酶的黄酮提取率在料水比1∶40（g/mL）时最高，随后黄酮得率呈下降的趋势。料水比过低的时候，溶剂用量少，原料浸润不完全，影响黄酮的析出，随着料水比过高时会导致其他组分与黄酮的同时析出，从而影响显色反应及提取效率。在料水比试验当中黄酮提取得率最高的酶仍为纤维素酶，黄酮得率达到57.949 mg/g，其次为木瓜蛋白酶53.077 mg/g，最后为果胶酶47.186 mg/g。

2.1.5 酶解温度对黄酮提取的影响

选定酶解温度进行单因素试验，考察该因素对黄秋葵果实中黄酮得率的影响。根据不同酶的特点选择其最适pH值及酶解时间，纤维素酶料水比为1∶50（g/mL），果胶酶及蛋白酶料水比为1∶40（g/mL），固定酶添加量为4%。酶解温度对黄秋葵黄酮得率影响见图5。

图5 酶解温度对黄秋葵黄酮得率的影响Fig.5The influence of extraction temperature on okra flavonoid yield

由图5可以看出，30℃～60℃时随着温度的上升，黄酮溶出的越多，因为纤维素酶、果胶酶的最适温度为60℃左右，提取黄酮得率分别为60.537、73.989 mg/g；蛋白酶的最适温度在50℃左右，此时提取黄酮含量为60.792 mg/g。在最适温度条件下，酶的活力最大，酶解反应加快，黄酮得率不断上升；超过最适温度后，酶活性减弱，酶的稳定性降低，并且温度过高还会破坏已经被提取出来的黄酮物质。

2.2 正交试验结果与分析

2.2.1 纤维素酶正交试验

在单因素试验的基础上，确定了相应的四水平，进行响应面分析，确定黄秋葵黄酮的最优提取方法，结果如表1所示。

表1 纤维素酶正交试验方案及试验结果Table 1Cellulase orthogonal test scheme and test results

纤维素酶的酶添加量为4%、缓冲溶液pH值为4.0、提取温度为60℃、料水比为1∶30（g/mL）、提取时间为150 min时提取量最大。影响条件：温度＞酶解时间＞pH值＞料水比＞酶添加量。提取的黄酮得率达到71.265 mg/g，提取得率高于果胶酶及纤维素酶。

2.2.2 果胶酶正交试验

在单因素试验的基础上，筛选出适当的因素及水平，进行响应面分析，确定黄秋葵黄酮的最优提取方法，结果如表2所示。

表2 果胶酶正交试验方案及试验结果Table 2Pectinase orthogonal test scheme and test results

续表2 果胶酶正交试验方案及试验结果Continue table 2Pectinase orthogonal test scheme and test results

由表2结果可以看出，在果胶酶添加量为2%，pH值为5，温度为60℃，料水比为1∶50（g/mL），提取时间为90 min时，提取效果最佳。影响条件：温度＞酶解时间＞酶添加量＞pH值＞料水比，提取的黄酮得率达到64.323 mg/g，提取效率略低于纤维素酶，但提取时间明显缩短。

2.2.3 木瓜蛋白酶正交试验

在单因素试验的基础上，筛选出适当的因素及水平，进行响应面分析，确定木瓜蛋白酶提取黄秋葵黄酮的最优条件，结果如表3所示。

表3 木瓜蛋白酶正交试验方案及试验结果Table 3Papain orthogonal test scheme and test results

续表3木瓜蛋白酶正交试验方案及试验结果Continue table 3Papain orthogonal test scheme and test results

木瓜蛋白酶的酶添加量为2%、缓冲溶液pH值为4、提取温度为40℃、料水比为1∶40（g/mL）、提取时间为120 min时黄酮得率最高，提取的黄酮得率为63.411 mg/g。影响条件：提取温度＞料水比＞酶添加量＞pH值＞酶解时间，其提取效率低于纤维素酶及果胶酶，但提取温度较低，能耗较少。

2.3 验证性试验

为进一步考察上述优选工艺的稳定性，在2.2中3种酶最佳提取条件下，分别进行3次平行试验，最终纤维素酶的最佳提取得率平均为70.385 mg/g，果胶酶平均为64.522，木瓜蛋白酶平均为62.167，验证试验结果均优于正交其他条件，证明上述参数组合为最佳提取条件。

3 结论

在单因素试验结果的基础上，采用正交试验方法分别对黄秋葵果实总黄酮的提取工艺进行优化，获得了纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶提取黄秋葵果实黄酮的最佳反应条件。纤维素酶提取黄秋葵果实黄酮的最佳条件为：酶添加量4%，提取缓冲液pH值为4，提取温度60℃，料水比1∶30（g/mL），提取时间150 min，此时提取的黄酮得率平均值为70.385 mg/g；果胶酶提取时反应体系中果胶酶添加量2%，提取缓冲液pH值为4，提取温度60℃，料水比1∶50（g/mL），提取90 min时提取的黄酮得率最高为64.522 mg/g；木瓜蛋白酶提取黄秋葵果实黄酮效率最高的反应体系条件为：酶添加量2%，提取缓冲液pH值为4，提取温度40℃，料水比1∶40（g/mL），提取时间120 min，此时提取的黄酮得率平均值为62.167 mg/g。

试验结果表明，温度对黄秋葵果实黄酮的提取影响效果最大，因酶活力的高低与温度有直接关系，其余因素因酶不同而具有不同的影响效果。

黄秋葵黄酮体外抗氧化活性试验，证明了秋葵黄酮有较强的·OH、O2-·，DPPH自由基清除能力，表现出较好的体外抗氧化活性[9]，加之黄秋葵果实产量高，种植适应性广，原料易获取，因此黄秋葵黄酮的工业化应用具有一定的开发研究价值，本研究为该类工作的开展提供的工艺研究基础。

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Optimization of Bio-enzyme Method for Flavones Extraction from Okra Fruit

WANG Wei-ting1，2，CAO Hong-jie3，GUO Xu1，2，CHENG An-wei1，2，LIU Chao1，2，SUN Jin-yue1，2，*
（1.Institute of Agro-Food Science&Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，Shandong，China；2.Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province，Jinan 250100，Shandong，China；3.College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In order to optimize the fruit extraction technology of falconoid，bio-enzyme method was applied for total flavones extraction from okra fruit.The impact of flavones of enzyme concentration，pH，temperature，mass ratio of material to water，time had been discussed.Basing on the single factor experiments，orthogonal design experiments had been used to optimized the extraction condition.However，the okra fruit highest flavonoid content could reached to 70.385，64.522，62.167 mg/g using the cellulase，pectinase，papain extraction under the optimal conditions.

okra；flavonoids；pectinase；cellulase；papain

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.027

2016-07-18

山东省农业科学院青年科研基金项目（2014QNM55）；山东省自主创新成果转化专项（2014CGZH0712）

王维婷（1981—），女（汉），副研究员，博士，主要从事生物活性物质提取与功能鉴定研究。

*通信作者：孙金月（1967—），男，研究员，主要从事生物活性物质与功能食品研究。