头孢他美酯与牛血清白蛋白的相互作用

刘 里，成飞翔

(曲靖师范学院化学化工学院，云南 曲靖，655011)

头孢他美酯与牛血清白蛋白的相互作用

刘 里*，成飞翔

(曲靖师范学院化学化工学院，云南 曲靖，655011)

在最佳实验条件下，光谱法研究牛血清白蛋白(BSA)和头孢他美酯(CP)结合反应的特征。结果表明：CP对BSA的荧光有猝灭作用，属于静态猝灭。BSA能运输CP，其作用力类型主要为氢键和范德华力。BSA 的亚螺旋域ⅡA是主要结合位置，有弱的负协同作用。CP对BSA构象几乎不产生影响，结合位点更接近于酪氨酸。关键词： 头孢他美酯；牛血清白蛋白；荧光光谱法

我国是滥用抗生素情况最严重的国家之一，严重危害着人和动物的生命安全。头孢他美酯(Cefetamet Pivoxil，简称CP)又称头孢美特酯，主要用于敏感菌所致的呼吸道炎症和各器官等感染[6]，是一种非处方的常用抗生素。所以研究CP与BSA的相互作用对理解药物的作用机制具有重要意义。分子光谱法研究各类药物与BSA的相互作用已有大量报道[1-5]，而BSA与CP的相互作用却未见报道。笔者探讨了3个温度下头孢他美酯与BSA的结合位点数、类型、部位、药物协同作用、药物对蛋白质构象的影响，以期对该类药物的临床应用提供有价值的理论信息。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

日本日立公司F-4600型荧光光谱仪，美国瓦里安技术中国有限公司Cary 50型紫外—可见光谱仪，上海虹益仪器仪表有限公司pHS-3C型精密酸度计，上海一恒科技有限公司HWS12型超级恒温水浴。头孢他美酯，71.3%，中国药品生物制品检定所生产；牛血清白蛋白，北京奥博星生物技术有限责任公司生产，放入4 ℃的冰箱保存，现用现配。其它试剂为分析纯，用水为超纯水。

1.2 实验方法

依次加入CP溶液(0，0.206 5，0.413 1，0.619 6，0.826 2，1.032 7，1.290 9，1.549 1，1.807 2，2.065 4，2.323 6，2.581 8)×10-5mol/L (编号分别为1～12)，BSA溶液(1.5×10-6mol/L) 1.0 mL，0.5 mol/L NaCl 2.0 mL，0.2 mol/L Tris-HCl(pH 7.4) 2.5 mL于10 mL比色管中定容。在289，299，309 K温度下孵育35 min后，扫描荧光光谱和同步荧光光谱(Δλ=15 nm和60 nm)，记录不含CP时体系的荧光强度F0和含CP时体系的荧光强度F。按照上述条件，扫描体系的吸收光谱。

2 结果与分析

2.1 条件的优化

优化了体系的加入顺序，pH值，BSA浓度，孵育时间等。最佳条件为按照CP，BSA，NaCl，Tris-HCl的顺序加入，pH 7.4，BSA浓度为1.5×10-6mol/L，孵育35 min后，猝灭效果最佳。

2.2 CP-BSA体系的猝灭光谱

图1为CP-BSA体系的荧光发射光谱图，其最大激发波长λex位于280 nm，最大发射波长λem位于345 nm处。随着CP浓度的增大，BSA的荧光强度逐渐减小，表明CP对BSA的荧光有猝灭，发生了相互作用。

2.3 猝灭机理的探讨

荧光猝灭机理通常可分为动态猝灭和静态猝灭[5～7]。在静态猝灭过程中，温度越高，稳定性越差，猝灭常数Ksv越小[5～7]。因分子扩散起主导，在动态猝灭中Ksv会随着温度的升高而增大。猝灭过程常用Stern-Volmer方程[5～7]表示：F0/F=1+Kqτ0[CP]=1+Ksv[CP]，式中[CP]为头孢他美酯的浓度，加入CP前后的荧光强度F0和F。Kq为速率常数；τ0为荧光寿命，10-8s数量级左右[5～7]。在289，299，309 K时作Stern-Volmer曲线(图2)，由图2可知，随着温度的升高，直线斜率即Ksv降低，与静态猝灭机理吻合。表1中3个温度下的Kq值比2.0×1010L·(mol·s)-1(最大动态猝灭速率常数)[5～7]大2个数量级，表明不是动态猝灭过程。

图1 CP-BSA的荧光光谱 图2 3个不同温度下的Stern-Volmer图

表1 Stern-Volmer方程与相关参数

2.4 Lineweaver-Burk方程

表2 Lineweaver-Burk方程及相关参数

2.5 紫外光谱

紫外吸收光谱也是一种区分猝灭机理的重要方法[8～10]，绘制体系的吸收光谱图(图3)；对比曲线1(BSA)和曲线2～曲线12(CP-BSA)可知，随着CP的加入，使BSA吸收峰的峰形与峰位(275nm蓝移到264nm)以及吸收强度都发生了改变，表明推断CP与BSA静态猝灭机理是合理的。

2.6 结合常数和结合位点数

BSA大分子与CP小分子结合的结合常数Kb与结合位点数n可由：双对数方程lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[CP][8～10]求出。在289，299，309K温度下绘制lg(F0-F)/F～lg[CP]的双对数曲线，求得Kb和n值(表3)。随温度的升高，Kb和n逐渐减小，也验证了静态猝灭机理的正确性。n≈1，形成一个结合位点，但高温不利于CP与BSA结合。

表3 结合常数Kb和结合位点数n

2.7 作用力类型

根据热力学方程[10～12]算出反应体系的熵变ΔS，焓变ΔH和吉布斯自由能变ΔG(表4)。由表4可知，ΔG<0， ΔH<0， ΔS<0，表明CP与BSA结合为自发进行的放热反应，氢键和范德华力起主要作用。

表4 不同温度下的热力学常数和nH值

2.8 结合位置的确定

BSA 是由二硫键连接起来的几个螺旋状区域所组成的[13～15]。药物与BSA结合位点分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。位点Ⅰ位于亚螺旋域ⅡA中，而位点Ⅱ和Ⅲ位于亚螺旋域ⅢA的疏水腔中[13～15]。由图4可知，λex=280，295 nm的CP-BSA光谱曲线没有重叠，表明色氨酸和酪氨酸残基都参与其中；λex=280 nm的荧光猝灭程度比λex=295 nm的大，结合位置主要在亚螺旋域ⅡA中。

图3 BSA(曲线1)和CP-BSA(曲线2～曲线12)紫外吸收光谱 图4 λex=295，280 nm的荧光光谱

2.9 药物协同作用

药物的协同作用常用Hill方程[13～15]进行分析：lgS(Sm-S) =lgS+nHlg [CP]，式中nH为Hill系数，K为结合常数，S=(F0-F)/F0为饱和分数，1/S对1/[CP]作图，截距为1/Sm，由表4可知，各温度下的nH值都略小于1，并随温度的增加nH值减小，表明CP分子之间呈现出微弱的负协同作用，即一个CP结合到BSA结合位点上后，会阻碍后继药物分子与蛋白质的结合。温度越高，药物越难结合到位点上。这种负协同作用可能是由于药物分子结构决定的，CP浓度的加大，导致后续CP对BSA的亲和性降低。

2.10 CP对BSA构象的影响

同步荧光光谱法是分析药物小分子对影响蛋白质的构象的常用方法，在Δλ=15 nm(酪氨酸残基)和Δλ=60 nm(色氨酸残基)条件下绘制CP-BSA体系的同步荧光光谱(图5)[13～15]。由图5可知，随CP浓度的增大，这两种氨基酸残基的λem几乎没有发生移动，说明CP的加入不改变了BSA的构象[13～15]。酪氨酸残基的猝灭程度大于色氨酸残基，表明结合位点偏向于酪氨酸。

图5 同步荧光光谱图

3 结 论

头孢他美酯与BSA的相互作用是静态猝灭过程，两者通过氢键和范德华力相互作用，因有结合位点，药物能被蛋白质转运和储存；有微弱的药物负协同作用，结合位置在BSA的亚螺旋域ⅡA中，靠近酪氨酸残基，CP对BSA构象几乎不产生影响，这些重要信息为后续头孢类药物的研发和进一步探讨CP在生物体内与蛋白质的作用机制和生物学效应提供了理论依据。

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(责任编辑：朱宝昌)

Studies on Interaction Between Cefetamet Pivoxil and Bovine Serum Albumin

LIU li, CHENG Feixiang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University,Qujing Yunnan, 655011, China)

The interaction between Bovine Serum Albumin (BSA) and Cefetamet Pivoxil(CP) was studied with spectrometry under the optimal conditions. The results showed that the fluorescence of BSA was quenched by CP, which was a static quenching process. BSA could transport CP, which was mainly driven by hydrogen bond and Vander Waals force. The primary binding site for CP was located at sub-domain ⅡA of BSA. There displayed some weakly negative cooperative effect. The conjugation reaction would hardly affect the conformation of BSA, and the binding site was near to tyrosine residue. This test could provid references for its clinical application.

cefetamet pivoxil; bovine serum albumin; fluorescence spectroscopy

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.01.009

云南省教育厅科学研究基金项目(项目编号：2015C090Y)。

2016-03-02

O482.31;O657.3

A

1672-7983(2017)01-0044-04

刘里(1982-)，女，讲师。主要研究方向：药物化学和分子发光学理论与应用。