促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及对cleaved Caspase-3蛋白表达的影响△

伍金雷，许 卫，陈永权，谢文杰，陈晞明，陈盛强，张银霞

（1.广州医科大学附属第三医院心内科，广州510150；2.广州医科大学附属第二医院，广州510150；3.广州医科大学金域检验学院，广州510150）

促红细胞生成素对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及对cleaved Caspase-3蛋白表达的影响△

伍金雷1，许 卫1，陈永权1，谢文杰1，陈晞明1，陈盛强2，张银霞3

（1.广州医科大学附属第三医院心内科，广州510150；2.广州医科大学附属第二医院，广州510150；3.广州医科大学金域检验学院，广州510150）

目的观察促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌细胞的抗凋亡作用及对活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）蛋白表达的影响。方法将36只雄性成年SD大鼠随机分为3组，分别为假手术（Sham）组（n=12）、EPO组（n=12）和对照（Control）组（n=12）；其中EPO组和Control组大鼠使用腹主动脉缩窄术建立慢性心力衰竭模型，术后第8周EPO组经腹腔注射3 000 U/kg EPO，3次/周，连续4周；Sham组、Control组经腹腔注射等量等次0.9%氯化钠溶液。术后第4周、8周、12周行超声心动图检测大鼠心功能。术后第12周末全部大鼠禁食24 h后处死，取心肌组织切片采用苏木精-伊红（HE）染色法观察心肌组织细胞形态，采用Tunel法观察心肌细胞凋亡及计算凋亡指数（apoptosis index，AI）；采用Western blot法检测心肌cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果超声心动图结果显示，造模大鼠术后第4周时出现心室肥厚，术后第8周时出现左心室射血功能减退；EPO组干预4周后较Control组左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）明显升高（P<0.05），收缩末期室间隔厚度（IVSs）、收缩末期左心室后壁厚度（LVPWs）、舒张末期室间隔厚度（IVSd）、舒张末期左心室后壁厚度（LVPWd）明显降低（P<0.05）。EPO组AI相比Control组显著降低（23.87%±1.45%vs.35.58%±2.81%，P<0.01）；与Sham组比较，Control组cleaved Caspase-3 OD值明显增加（0.3 145±0.0 308 vs.0.9 007±0.0 339，P<0.01）；与EPO组相比，Control组减少（0.4 893±0.0 683 vs.0.9 007±0.0 339，P<0.01），差异均有统计学意义。结论EPO可明显改善慢性心力衰竭大鼠的心功能，减少心肌细胞凋亡，对心肌具有保护作用，其机制可能与下调凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3蛋白表达相关。

促红细胞生成素；心力衰竭；心肌凋亡；cleaved caspase-3蛋白

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）作为多种心血管疾病的最终发展结果，不仅严重影响着患者的健康水平及生活质量，而且给患者家庭带来了沉重的经济负担［1］。近来有研究证明，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对急性心肌梗死、急性心力衰竭大鼠心肌均具有保护作用［2-3］。但是目前而言，EPO对治疗CHF的相关研究尚少见报道。本研究拟通过建立大鼠CHF模型并以EPO干预，观察超声心动图、心肌细胞组织形态、心肌细胞凋亡率以及凋亡相关基因cleaved Caspase-3蛋白的表达，探讨EPO是否具有抗CHF心肌凋亡作用及其可能的机制，为CHF的临床治疗提供一个新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动 物 8～12周龄无特定病原体（SPF）级成年雄性SD大鼠共40只，体质量（241.40±16.70）g，购自南方医科大学实验动物中心。所有大鼠均在相同的条件下饲养，自由饮水和取食。饲料购自南方医科大学实验中心。

1.1.2 药品及试剂 EPO（10 000 U/mL）购自沈阳三生制药公司，TUNEL试剂盒购自Roche公司，cleaved Caspase-3抗体购自Cell Signaling Technolo⁃gy（USA），β-actin抗体购自ProteinTech Group，Inc（USA）。

1.2 方 法

1.2.1 分组及模型建立 40只成年雄性SD大鼠随机挑选出12只为假手术（Sham）组（n=12），其余大鼠通过行腹主动脉缩窄术提高大鼠心脏后负荷，建立CHF模型。简述如下：术前禁食24 h，称体质量，10%水合氯醛经腹腔注射（3 mL/kg）麻醉，打开腹腔、暴露左肾静脉，左肾静脉和下腔静脉交点上方约10～15 mm处钝性分离筋膜，暴露腹主动脉，用4-0丝线穿过分离的腹主动脉，在腹主动脉上放置预处理磨钝后的7号输液针头（直径0.7 mm），与腹主动脉平行，结扎后拔针，拔针时以稍有紧箍感为宜，使腹主动脉缩窄达60%～70%，收纳脏器，关闭腹腔。待大鼠苏醒后即经腹腔注射阿米卡星（0.2 mL/d）抗感染，连续3 d。术后正常饲养并观察8周，制成CHF模型。Sham组：在分离的腹主动脉相同部位穿线但不结扎，余建模流程同建模组。

1.2.2 模型分组和干预 术后第8周，将造模成功的存活CHF大鼠用随机数字表法分成EPO组（n= 12）和将10 000 U/mL EPO用0.9%氯化钠溶液稀释成1 000 U/mL，EPO组大鼠经腹腔注射EPO（3 000 U/kg），3次/周，连续4周［4］。Control组（n=12）经腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，3次/周，连续4周。Sham组处理同Control组。术后第12周各组大鼠无死亡。

1.2.3 超声心动图检查 在术后第4周、8周、12周行超声心动图检查大鼠心功能情况。禁食24 h后，10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉、备皮，应用超声心动仪（ie33型号，PHILIPS公司）及7.5 MHz高频线控探头（PHILIPS公司）进行超声检测。检测左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、舒张末期室间隔厚度（end-diastolicinterventricular septum thickness，IVSd）、舒张末期左心室后壁厚度（end-diastolic left ventricular posterior wall thickness，LVPWd）、收缩末期室间隔厚度（endsystolic interventricular septum thickness，IVSs）、收缩末期左心室后壁厚度（end-systolic left ventricular posterior wall thickness，LVPWs）。

1.2.4 心内采血和心肌组织标本处理 术后第12周全部大鼠完成超声心动图检查后，10%水合氯醛经腹腔注射（3 mL/kg）麻醉，暴露胸腔，1 mL注射器从心尖进针采血1 mL，注入抗凝管待送检血常规，然后剪取心尖部约5 mm×5 mm×5 mm心肌组织，放入预冷至4℃的磷酸盐缓冲液（PBS）中冲洗至溶液无血色，置于液氮中速冻后存于-80℃超低温冰箱，待分子生物学实验用；剩余部分心脏组织经预冷的0.9%氯化钠溶液溶液灌注3 min，再经4%多聚甲醛溶液灌注固定20～30 min后剪取心脏，置于4%多聚甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋，制成3～4 μm厚石蜡切片，待用。

1.2.5 病理检查 经上述步骤制成的石蜡切片中，各组中随机选择3张切片，采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色后置于200倍光镜下观察，镜下观察各组心肌组织细胞形态结构及炎症细胞浸润情况。

1.2.6 TUNEL原位末端标记法检测细胞凋亡 从石蜡切片中，各组随机选择3张切片，按照TUNEL试剂盒操作方法处理，在荧光显微镜下观察凋亡细胞并采取图像，再进行二氨基联苯胺（DAB）显色，每张切片在高倍镜（×400）下随机读取6个不重叠视野，细胞核染成棕色者计为阳性细胞。计数后，计算细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）=单视野凋亡阳性细胞数/单视野总细胞计数×100%，取其平均值进行统计学分析。

1.2.7 Western blot法测定cleaved Caspase-3蛋白表达 心肌组织经研磨、裂解后用酶标仪测蛋白浓度，根据所测得的蛋白浓度上样总蛋白质量为120 μg，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，采用电印迹转移法将蛋自质转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，丽春红S染色，根据所需目标条带剪膜，用质量浓度为5%的脱脂奶粉的TBS-T溶液室温封闭2 h后，分别加入兔抗Caspase单克隆抗体和β-actin抗体，4℃孵育过夜，室温下TBS-T溶液洗膜后加入兔（鼠）二抗孵育2 h，用TBS-T溶液洗膜后与ECL试剂反应5 min，胶片曝光，扫描胶片，用Quantity One软件计算条带光密度（OD）值，以cleaved Caspase-3与β-actin条带的OD积分比值来评定的cleaved Caspase蛋白的表达水平。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。实验数据以（±s）表示，2组间均数比较采用t检验；多组均数间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建模、EPO干预前后超声心动图指标的变化

术后第4周，Sham组与建模组大鼠LVEF差异无统计学意义（P>0.05）；建模组LVPWd、IVSd、LVPWs、IVSs显著升高（P<0.05），表明建模组大鼠心脏发生心肌肥厚。术后第8周，建模组大鼠LVEF显著下降（P<0.01），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd仍高于Sham组（P<0.05），表明建模组大鼠经结扎缩窄腹主动脉后发生心力衰竭，CHF模型建立成功。术后第12周，相比Sham组（图1-A），Control组大鼠LVEF进一步下降（P<0.05），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd进一步增高（P<0.05），见图1-B，侧面反映Control组大鼠心力衰竭进一步加重。与Control组比较，EPO组大鼠LVEF明显增加（P<0.05），LVPWs、IVSs、LVPWd、IVSd明显降低（P<0.05），表明EPO干预CHF大鼠能够逆转其心室肥厚、改善心功能，详见图1-C、表1。

图1 各组大鼠超声心动图检查图像（A：sham组；B：Control组；C：EPO组）

表1 各组术后第4、8、12周超声心动图检查指标比较 （±s）

表1 各组术后第4、8、12周超声心动图检查指标比较 （±s）

注：*P<0.05，**P<0.01；与Sham组比较，aP<0.01；与Control组比较，bP<0.05

组别Sham组建模组t值Sham组建模组t值Sham组Control组EPO组F值周数n 4 4 8 8 1 2 12 24 12 24 12 12 12 12 12 LVPWs（cm）0.276±0.005 0.355±0.015 5.467＊＊0.297±0.020 0.381±0.021 5.237＊＊0.310±0.039 0.439±0.009a0.354±0.008b10.177＊＊IVSs（cm）0.278±0.007 0.327±0.060 2.420＊0.311±0.008 0.364±0.022 3.265＊＊0.334±0.017 0.392±0.010a0.375±0.019b5.755＊LVPWd（cm）0.171±0.008 0.264±0.012 3.136＊0.192±0.009 0.294±0.025 3.148＊＊0.206±0.013 0.307±0.011a0.243±0.014b13.584＊＊IVSd（cm）0.167±0.004 0.228±0.013 2.283＊0.187±0.008 0.242±0.020 2.515＊0.199±0.011 0.271±0.008a0.215±0.015b7.322＊＊LVEF 0.884 8±0.1832 0.826 0±0.1305 1.409 0.865 7±0.1453 0.655 7±0.1672 8.426＊＊0.8235±0.1378 0.6063±0.2721a0.716 6±0.3482ab32.308＊＊

2.2 各组苏木素-伊红染色结果比较

Sham组大鼠心肌细胞染色清晰、排列整齐而紧密，结构完整，细胞核致密、清晰可见，呈椭圆形或长杆形，显蓝色，见图2-A。Control组心肌细胞较肥大、细胞间间隙增宽、排列紊乱，可见间质增生、纤维化，细胞核着色不均，心肌肌节增多、肌纤维间疏松水肿，见图2-B。相比Control组，EPO组心肌细胞排列紊乱、间质增生水肿及炎性细胞浸润、聚集的表现有所减轻，见图2-C。

图2 光镜下心肌组织切片（HE，×200；A：Sham组；B：Control组；C：EPO组）

2.3 各组心肌细胞凋亡的变化

Sham组细胞核染为蓝色，清晰可见，边界清楚。见图3-A。Control组可见大量棕色深染的固缩、聚集呈棒状的细胞核（箭头所示），为发生凋亡的细胞核，见图3-B。EPO组深染棕色细胞核较Control组明显减少，见图3-C。与Sham组比较，Control组AI显著增加；与Control组比较，EPO组 AI有所降低，但仍高于Sham组（P<0.01），见表2。

2.4 Western blot法检测心肌cleaved Caspase-3蛋白表达

与Sham组比较，Control组cleaved Caspase-3/ β-actin相对表达量（OD）值明显升高；与Control组比较，EPO组cleaved Caspase-3相对表达量值显著降低，但高于Sham组（P<0.05），见图4、表2。

图3 光镜下心肌细胞凋亡组织切片（TUNEL，×400；A：Sham组；B：Control组；C：EPO组）

图4 Western blot检测各组大鼠建模12周心肌cleaved Caspase-3蛋白的表达情况

表2 各组cleaved Caspase-3蛋白相对表达量及心肌细胞AI比较 ［n=12，±s］

表2 各组cleaved Caspase-3蛋白相对表达量及心肌细胞AI比较 ［n=12，±s］

组别Sham组Control组EPO组F值cleaved Caspase-3/-actin 0.3 145±0.0 308 0.9 007±0.0 339 0.4 893±0.0 683 153.438**AI（%）8.03±0.89 35.58±2.81a23.87±1.45ab53.128**

3 讨论

心力衰竭是各种病因导致的以心脏收缩和（或）舒张功能受损为特点的器质性心脏病的终末阶段，是心脏病患者死亡的重要原因之一。近年来，随着人们对心力衰竭发病机制的认识不断深入，发现细胞凋亡作为一种不同于坏死的细胞损伤机制，参与了CHF的病理生理过程［4］，是心力衰竭发生、发展的重要机制之一［5］。心肌细胞凋亡可使心肌细胞数量减少，当心肌细胞数量减少至一定程度，则影响了心脏的正常舒缩功能，最终引致心肌肥大、心室壁变薄、心腔扩大等心室重构表现。心肌细胞凋亡与炎性细胞因子、交感神经活性增加、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活等多因素的作用最终导致CHF。新近研究发现，EPO除了具有造血作用外，还具有抗凋亡、抗氧化、抗炎、减轻水肿、促进新生血管生成等细胞保护作用（神经、血管平滑肌、子宫等非造血组织）［6］。而且有研究表明，EPO受体在心血管系统有广泛的表达。然而，EPO能否通过抗细胞凋亡作用改善CHF心功能、逆转心室肥厚的研究，国内、外少见报道。本研究对大鼠采用腹主动脉缩窄术建立CHF模型。腹主动脉缩窄术是建立压力超负荷心力衰竭模型常用的方法，在腹主动脉缩窄术术后6周大鼠出现失代偿性心力衰竭［7］，本研究在腹主动脉缩窄术后第8周（EPO干预前）行超声心动图表明造模大鼠心脏肥厚、LVEF降低，这与以往的研究相同［7］，表明CHF模型建立成功。术后第12周（EPO干预后），EPO组较Control组心功能参数上，LVPWs、 IVSs、LVPWd、IVSd及LVEF明显改善，表明EPO能改善心力衰竭大鼠心功能，逆转心室肥厚。本研究结果显示，与Sham组相比，Control组心功能显著降低，细胞AI显著升高，cleaved Caspase-3表达显著增加；EPO干预后，EPO组心功能较Control组改善，细胞AI较Control组减轻，cleaved Caspase-3表达显著减少。该研究结果不仅证实心肌细胞凋亡是CHF的发生、发展及恶化的重要环节，同时还表明EPO干预可有效改善CHF大鼠的心功能，该作用可能与抑制凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3的表达，减少心肌细胞凋亡有关。

有研究表明，心力衰竭时予EPO干预可介导多条信号转导途径发挥抑制心肌细胞凋亡和改善心脏功能的作用。其中主要有PI-3K-Akt途径［8］，而本研究的主要研究对象凋亡蛋白剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 cleaved Caspase-3是经PI-3KAkt途径调控的细胞凋亡终末执行因子，可以激活核内核酸酶裂解DNA片段从而触发凋亡，在细胞凋亡发生、发展过程中发挥重要作用［9-11］。因此，抑制cleaved Caspase-3表达可有效减少心肌细胞凋亡，从而对CHF的治疗发挥积极的影响。而本实验所检测指标cleaved Caspase-3表达减少说明EPO干预CHF可抑制心肌细胞凋亡，从而减轻心肌细胞的损伤，改善心力衰竭。其机制可能与EPO激活caspase家族上游调控因子发挥抗心肌细胞凋亡的保护作用相关［12］。

综上所述，在CHF模型大鼠中，EPO具有抗心肌凋亡，逆转心室重构、改善心功能的作用，这与相关研究结论一致［13-14］。EPO通过减少凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3的表达发挥抗凋亡作用，由于细胞凋亡及抗细胞凋亡的信号途径众多且复杂，本研究未能阐明EPO下调cleaved Caspase-3蛋白表达的具体信号途径及EPO作用相关的受体位点，有待今后进一步的研究揭示。

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Erythropoietin effect on expression of cleaved Caspase-3 protein in rat with chronic heart failure

WU Jin-lei1，XU Wei1，CHEN Yong-quan1，XIE Wen-jie,CHEN Xi-ming1，CHEN Sheng-qiang2，ZHANG Yin-xia3
（1.Department of Cardiology，The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China；2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China；3.The King Med Shool of Laboratory Medicine，Guangzhou 510150，China）

ObjectivesAnti-apoptotic effects of chronic heart failure（CHF）was observed in rat cardiomyocytes erythropoietin（EPO）and its effect on protein cleaved cysteine-containing aspartate-specific proteases（cleaved Cas⁃pase-3）expression.MethodsFirstly，36 male adult SD rats were randomly divided into three groups as sham-operat⁃ed（Sham）group（n=12），EPO group（n=12）and control（Control）group（n=12）.CHF model was built by abdomi⁃nal aortic coarctation in EPO group and Control group.EPO group received 3 000 U/kg EPO by intraperitoneal injection 3 times/week for 4 weeks in 8 weeks postoperatively.Sham group and Control group received equal normal saline in dos⁃age and frequency.Respectively，after 4 weeks，8 weeks，12 weeks cardiac function were checked by echocardiography. After 12 weeks，all rats were sacrificed after 24 h fasting.Myocardial tissue section was used to observe cell morphology by hematoxylin and eosin（HF）staining.Myocardial apoptosis was observed by Tunel assay and apoptosis index（AI）was calculated.And myocardial cleaved Caspase-3 protein expression was examined by Western blot assay.ResultsEchocardiography showed CHF rats had ventricular hypertrophy in 4 weeks postoperatively，and had de⁃creased left ventricular ejection fraction（LVEF）in 8 weeks postoperatively.Compared with Control group，LVEF was significantly higher（P<0.05），end-systolic interventricular septum thickness（IVSs），end-systolic left ventricular pos⁃terior wall thickness（LVPWs），end-diastolic interventricular septum thickness（IVSd），end-diastolic left ventricular posterior wall thickness（LVPWd）was significantly lower（P<0.05）in EPO group in 4 weeks postoperatively.AI in EPO group was significantly lower than that in Control group（23.87%±1.45%vs.35.58%±2.81%，P<0.01）.Compared with Sham group，cleaved Caspase-3 OD values significantly increased in Control group（0.3 145±0.0 308 vs.0.9 007± 0.0 339，P<0.01）.Compared with Control group，cleaved Caspase-3 OD values in EPO group significantly decreased（0.4 893±0.0 683 vs.0.9 007±0.0 339，P<0.01）.ConclusionsEPO can improve heart function in rats with CHF，in⁃hibition of cardiomyocyte apoptosis，and can reduce express of cleaved Caspase-3.

erythropoietin；heart failure；cardiac apoptosis；cleaved Caspase-3 protein

R541.6

A

：1007-9688（2017）02-0209-06

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.02.22

2016-05-26）

广东省科技厅项目（项目编号：2013B022000103）。

伍金雷（1991-），男，在读硕士研究生，住院医师，研究方向为冠心病防治。

陈晞明，E-mail：13903004891@163.com