独活寄生汤对硝普钠诱导软骨细胞凋亡模型增殖的影响

王武炼　林煜　张怡元　刘振涛　肖莉莉　刘献祥

[摘要] 目的 探讨独活寄生汤含药血清对硝普钠诱导的膝软骨细胞凋亡模型增殖的影响。 方法 不同浓度硝普钠（SNP）诱导软骨细胞凋亡，MTT法检测软骨细胞半数致死量（LD50）的硝普钠浓度，以确定硝普钠最佳诱导浓度；10%独活寄生汤含药血清干预72 h后，光学显微镜观察细胞形态变化；Hoechst 33258染色，荧光倒置显微镜观察细胞凋亡情况。qPCR法检测各组转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA的表达。 结果 1 mM硝普钠为最佳诱导浓度；含药血清干预后，软骨细胞的凋亡率降低，干预组低于模型组，空白组软骨细胞中TGF-β1 mRNA的表达最高，模型组最低，干预组介于两组之间，各组比较差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 独活寄生汤含药血清能抑制硝普钠诱导体外培养的膝软骨细胞凋亡模型的凋亡。

[关键词] 独活寄生汤；凋亡；软骨细胞；增殖

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）34-0098-03

Effects of parasitic soup on proliferation of chondrocyte apoptosis model induced by sodium nitroprusside

WANG Wulian1 LIN Yu1 ZHANG Yiyuan1 LIU Zhentao1 XIAO Lili1 LIU Xianxiang2

1.Department of Joint Surgery， Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University， Fuzhou 350007， China； 2.Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350102， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of serum containing parasitic soup on the proliferation of knee chondrocytes apoptosis model induced by sodium nitroprusside. Methods Since different concentrations of sodium nitroprusside （SNP） induced chondrocyte apoptosis，the half-lethal dose（LD50） concentration of sodium nitroprusside sodium nitroprusside（SNP） in chondrocyte cell was determined by MTT assay to determine the optimal concentration of sodium nitroprusside（SNP）. The morphological changes of the cells were observed by light microscope after treated with 10% for 72 h. After being stained by the dye Hoechst 33258， cell apoptosis was observed by fluorescence inversion microscope. The expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1） mRNA was detected by qPCR. Results 1 mM sodium nitroprusside was the best induction concentration. The apoptosis rate of chondrocytes decreased after treatment with serum containing drugs，and the apoptosis rate of the intervention group was lower than that of model group.The expression of TGF-β1 mRNA in the chondrocytes in the blank group was the highest， the lowest in the model group and the level of TGF-β1 mRNA in the treatment group was between the two groups. There was significant difference between the three groups（P<0.01）. Conclusion The serum containing parasitic soup can inhibit the apoptosis of knee chondrocytes apoptosis model induced by sodium nitroprusside in vitro.

[Key words] Parasitic soup； Apoptosis； Chondrocytes； proliferation

軟骨细胞的凋亡是膝骨关节炎（KOA）的发生发展中重要环节，而一氧化氮（NO）在软骨细胞的凋亡中起着关键作用。前期研究显示独活寄生汤治疗OA久痹而致肝肾两虚，气血不足证能获得良好疗效[1]。本研究采用硝普钠诱导软骨细胞NO调控通路，促进其凋亡来模拟OA发展过程，并用独活寄生汤含药血清干预凋亡模型，探讨独活寄生汤对体外软骨细胞凋亡模型的影响，为临床防治KOA提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药物

2月龄雄性清洁级SD大鼠40只，4周龄SPF级SD大鼠10只[上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2007-0011]。独活寄生汤剂量及组成参照唐·孙思邈《备急千金要方》原方（厦门大学附属福州第二医院药剂科）。

1.2 试剂及检测仪器

DMEM 低糖培养基、BPS、0.25%胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液（Hyclone公司）；胎牛血清（四季青公司）；Ⅱ型胶原酶粉末（Sigma公司）；Hoechst 33258试剂盒（Invitrogen公司）；Prime ScriptTM RT和SYBRR PCR Kit（宝生公司）；二氧化碳培养箱，Elx800酶标仪（美国BioTek公司），荧光倒置相差显微镜（徕卡仪器公司）。

1.3 方法

1.3.1 含药血清制备 随机将2月龄清洁级雄性SD大鼠40只分为生理盐水对照组13只[按10 mL/（kg·d）的量给予0.9%生理盐水]和独活寄生汤临床等效剂量组27只[按9.3 g/（kg·d）的量给予独活寄生汤]。连续灌胃7 d，在末次灌胃2 h后，腹主动脉采血、离心，取血清，-20℃冻存。

1.3.2 软骨细胞分离培养与鉴定 取4周龄SD大鼠的膝关节软骨，采用Ⅱ型胶原蛋白酶消化法分离软骨细胞，培养调节为：5% CO2，1次/2 d更换培养基，采用倒置相差显微镜观察分离的细胞，待细胞贴壁至80%后进行传代。取第2代细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化法染色，鉴定分离细胞是否为软骨细胞。

1.3.3 确定最佳诱导浓度 将密度为1×104细胞接种于96孔板，在培养基中加入硝普钠，终浓度调整为0、0.5、1、2、3 mM，24 h孵育，MTT检测细胞在不同时间段下的存活率，半数致死量（LD50）最低的浓度即为最佳干预浓度。

1.3.4 细胞分组、形态观察及干预 将细胞以1×105个/mL接种于培养瓶中，过夜贴壁后继续培养24 h，随后分为3组。A组空白组（10%空白血清干预）；B组模型组（硝普钠诱导凋亡+10%空白血清干预）；C组干预组（硝普钠诱导凋亡+10%独活寄生汤含药血清干预）。72 h后观察细胞形态学变化，根据Hoechst33258说明书对细胞核染色，之后采用荧光显微镜拍照。采集各组软骨细胞，并进行指标检测。

1.3.5 qPCR檢测细胞TGF-β1的表达 用Trizol提取各组别软骨细胞总RNA，并按照说明书逆转录后在7500PCR仪上扩增，最终将所得CT值由软件换算成最终值。TGF-β1引物：5ACGCAACCAACATCCGCTA 35ACCGGTAAACCAGAGGAAT3；β-actin引物：5 CTTGACGGAGAAAAAGCCTC 35GCACAGTGAGGCTTGAACAA 3。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0软件，计量资料以（x±s）表示，采用t检验或单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 提取的软骨细胞形态变化及鉴定

刚从膝软骨分离的软骨细胞呈圆形并悬浮于培养液中，1 d后开始贴壁，3 d后贴壁细胞加速分裂增殖，5 d后软骨细胞呈铺路石样并成簇生长；培养至第8 d细胞增殖铺满瓶底。培养过程可见第2、3代细胞增殖速度最快、分泌基质的能力最强；当传至第4代后，细胞增殖速度减慢、体积增大、细胞核变大、胞膜和胞浆逐渐变模糊，同时细胞形态变得不规则，呈纤维细胞样改变。免疫组化鉴定显示：培养的细胞胞核不着色，胞浆呈棕黄色，即提取的细胞Ⅱ型胶原表达呈阳性（图1）。

2.2硝普钠诱导软骨细胞凋亡的剂量关系

实验结果显示，随着SNP浓度的增加，细胞的活力逐渐降低，具有浓度依赖性（图2）。结果显示半数致死率（LD50）为（1.145±0.073）mM。因此，本研究中选用1 mM SNP孵育24 h来诱导软骨细胞的凋亡模型。

2.3 独活寄生汤含药对SNP诱导的软骨细胞凋亡模型细胞形态学改变的影响

硝普钠干预软骨细胞24 h后，各组细胞形态变化明显：空白组细胞成簇生长，形态规则、边界清楚，以梭形和椭圆形为主，细胞核边缘整齐、大小较均一（封三图4A）；SNP诱导后，细胞变圆、变亮或萎缩，甚至相互分离或浮动在培养液中，细胞出现细胞核致密浓缩、核变亮、核碎裂或月牙状等细胞凋亡特征（封三图4B）；经过独活寄生汤含药血清干预后，变圆、变亮或萎缩，甚至相互分离或浮动在培养液中的细胞明显减少（封三图4C）。

2.4 独活寄生汤含药血清对软骨细胞凋亡模型TGF-β1的影响

SNP干预软骨细胞24 h后：空白组软骨细胞中TGF-β1mRNA的表达最高相对表达量为1，模型组最低为（0.452±0.012），干预组介于二组之间为（0.653±0.023），各组差异有统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

当前软骨细胞的提取多采用两种酶联合序贯消化法，但是由于分离步骤较多、操作复杂，且同时使用可能会对软骨细胞造成损伤[2-5]。有研究单纯采用Ⅱ型胶原蛋白酶分离膝软骨细胞，结果显示分离后软骨细胞活性良好[6，7]。因此本研究采用Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠膝软骨细胞：细胞培养结果证实采用此法不仅简化了分离的步骤，还减少了因多种酶反复消化、洗涤、离心而对软骨细胞造成的损伤，从而使分离获得的细胞具有良好的活性。在原代软骨细胞贴壁传代后软骨细胞贴壁和增殖的速率均加快，传代至第2、3代细胞增殖速度最快、分泌基质的能力最强，第4代后则呈“去分化”现象，这与之前文献研究结论相一致[8-10]。

KOA软骨细胞凋亡主要通过NO诱导途径和Fas介导途径发生，其中以NO依赖通路更重要[11]。硝普钠是一种由NO产生的供体，在KOA的发生早期阶段， NO产生的硝普钠等供体可诱导培养的软骨细胞凋亡且存在时间效应关系，因此NO及其产物升高导致软骨细胞凋亡是KOA发生的细胞机制[12，13]。因此，SNP作为NO的一种供体能模拟KOA患者关节腔内的微环境，复制体外培养软骨细胞凋亡的过程。TGF-β1是软骨的生长和重建的重要因子，影响着软骨细胞的增殖分化，同时发挥软骨诱导作用、促进软骨基质合成起着关键的作用。软骨细胞凋亡模型中的TGF-β1的表达与其细胞状态和增殖能力呈正相关，并最终与KOA的病情严重程度呈负相关性[14，15]。

本文利用硝普钠复制软骨细胞的凋亡模型，结果发现，随着SNP浓度的增加，细胞的活力逐渐降低，且具有浓度依赖性。而经过独活寄生汤含药血清干预后，培养液中的凋亡细胞明显减少，表明独活寄生汤含药血清能抑制硝普钠诱导体外培养的膝软骨细胞凋亡模型的凋亡。同时本研究采用Hoechst 33258染色观察其对软骨细胞细胞核形态学改变的影响，结果发现SNP诱导后，软骨细胞出现细胞核致密浓缩、核变亮、核碎裂或月牙状等细胞凋亡特征，经过独活寄生汤含药血清干预后，凋亡软骨细胞明显降低，而各组细胞中以空白组中TGF-β1mRNA的表达最高，模型组最低，干预组介于两组之间，各组比较差异有统计学意义（P<0.01），说明独活寄生汤可能通过抑制NO产生，提高软骨细胞的凋亡模型中TGF-β1的表达，发挥抑制软骨细胞的凋亡模型其退变的作用。总之，独活寄生汤含药血清能抑制硝普钠诱导的软骨细胞凋亡模型的凋亡，这可能是独活寄生汤治疗KOA的机制之一。

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（收稿日期：2016-09-23）