紫铆因改善化疗损伤卵巢功能的研究

张琼　梁宗文　张安琪　卢晓声　朱望爱　胡越

[摘要] 目的 探讨紫铆因对化疗所诱导大鼠卵巢功能损害的改善作用及其可能的作用机制。 方法 选择雌性Wistar大鼠随机分为对照组、化疗组、联合治疗组（环磷酰胺+紫铆因）和紫铆因组，每5天测重；苏木精-伊红染色观察卵泡发育和各级卵泡计数；Elisa法检测雌激素、孕激素水平；Western blot 检测Sirt1和Cleaved Caspase 3 蛋白表达水平。 结果 化疗组大鼠体重、卵巢质量明显小于对照组，联合治疗组则明显高于化疗组。化疗组大鼠动情周期紊乱，联合治疗组阴道细胞涂片表现为规律的动情周期。化疗组卵巢结构破坏，始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡均少于其他三组。联合治疗组血清E2水平显著高于化療组，FSH水平显著低于化疗组。Western blot结果显示化疗组Sirt1蛋白水平低于对照组，Cleaved Caspase 3蛋白水平高于对照组，相反，联合治疗组的Sirt1蛋白水平高于化疗组，Cleaved Caspase 3蛋白水平低于化疗组。 结论 紫铆因可以改善化疗对大鼠卵巢功能的损害，其作用机制可能与上调Sirt1抑制细胞凋亡相关。

[关键词] 紫铆因；化疗；卵巢；Sirt1；凋亡

[中图分类号] R711.75 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）34-0035-05

Study on the effect of butein on the improvement of impaired ovarian function induced by chemotherapy

ZHANG Qiong LIANG Zongwen ZHANG Anqi LU Xiaosheng ZHU Wangai HU Yue

Department of Gynecology and Obstetrics， the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of butein on the improvement of impaired ovarian function induced by chemotherapy in rats and its possible mechanism. Methods Female Wistar rats were randomly divided into control group， chemotherapy group， combined treatment group （cyclophosphamide+butein） and butein group. They were weighed every 5 days； the development of follicles and the count of follicles at all levels were observed by hematoxylin-eosin staining method. The levels of estrogen and progesterone were detected by Elisa method. Western blot was used to detect the expression level of Sirt1 and Cleaved Caspase 3. Results Rats' weight and ovary weight in the chemotherapy group were significantly lower than that in the control group， and the combined treatment group was significantly higher than that in the chemotherapy group； in the chemotherapy group， the estrous cycle of rats was disordered， and the vaginal smear in the combined treatment group showed regular estrous cycle； in the chemotherapy group， the structure of ovary was destroyed， and primordial follicles， primary follicles， secondary follicles and antral follicles were less than those in the other three groups； the level of serum estradiol was significantly higher in the combined treatment group than that in the chemotherapy group， and the level of FSH was significantly lower than that in the chemotherapy group； Western blot analysis showed that the level of Sirt1 protein in the chemotherapy group was lower than that in the control group， and Cleaved Caspase 3 protein level was higher than that in the control group. In contrast， the Sirt1 protein level in the combined treatment group was higher than that in the chemotherapy group， while the Cleaved Caspase 3 protein level was lower than that in the control group. Conclusion Butein can improve the impaired ovarian function induced by chemotherapy； the mechanism may be related to the up-regulation of Sirt1 on the inhibition of cell apoptosis.

[Key words] Butein； Chemotherapy； Ovary； Sirt1； Apoptosis

在女性生殖系统中，卵巢对化疗药物最敏感[1]，化疗药物在提高肿瘤和免疫性疾病治愈率的同时，会引起卵巢功能障碍、卵巢早衰甚至导致不孕不育，严重影响年轻妇女的生活质量和自信心[2]。因此，如何在使用化疗药物的同时保护女性的卵巢功能有巨大的医学需求。细胞凋亡被认为是化疗药物引起卵巢的结构及功能破坏从而导致卵泡丢失的机制之一[3]。据报道，Sirtuin在维持卵巢功能中起重要作用[4]。其中Sirtuin家族中的Sirt1，被称为是寿命延长的关键因子，是一种去乙酰化酶，能够将FOXO（forkhead box class O）去乙酰化从而抑制细胞凋亡[5]，而紫铆因是Sirt1的激活剂[6]，由此推测紫铆因是否能通过上调Sirt1而抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，从而对化疗损伤卵巢功能起到保护作用。

目前国内外均未见紫铆因与化疗损伤卵巢功能的相关报道，本文旨在探讨紫铆因预防性应用对化疗后卵巢组织结构、卵巢内分泌功能、各级卵泡数量所起的一系列作用及机制，为临床肿瘤治疗和免疫性疾病中应用大剂量的化疗药物后卵巢功能保护的药物开发提供有实用价值的科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

紫铆因（TCI公司，日本）、环磷酰胺（恒瑞医药股份有限公司，中国；国药准字H32020857，0.2 g）、兔抗Sirt1抗体（Cell Signaling公司，美国）、兔抗Cleaved-Caspase 3抗体（Cell Signaling公司，美国）、羊抗兔二抗（ICLlab公司，美国）、BCA试剂盒（Thermo公司，美国）、大鼠FSH、E2 Elisa盒（南京建成生物工程研究所，中国）。

1.2 实验动物

健康成年雌性清洁级Wistar大鼠[北京维通利华实验动物中心提供，SCXK（京）2011-0011]60只，体重250～280 g，标准条件（22℃～25℃，12 h照明）下饲养，自由取水。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 取2月龄雌性Wistar大鼠60只，经阴道涂片确认有正常性周期后开始实验。随机分为4组，对照组：不加任何处理；化疗组：建模后不做其他处理；联合治疗组：建模同时喂服紫铆因5 mg/kg 45 d；紫铆因组：不建模同期喂服紫铆因45 d。

1.3.2 建模 在体外建立化疗性卵巢早衰的大鼠模型，采用环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）腹腔注射建模，负荷剂量为50 mg/kg，之后按8 mg/kg的剂量连续腹腔注射14 d[7]。

1.3.3 观察指标 观察大鼠体重、动情周期及卵巢大体情况，在建模前及建模起每天阴道涂片观察大鼠动情周期，每5天监测大鼠体重，并于建模后45 d处死大鼠，取出双侧卵巢，观察大体外观变化及称重。

1.3.4 检测大鼠卵巢的病理改变 将实验所得大鼠一侧卵巢HE染色切片，观察组织形态学变化和卵泡计数。计算方法：计数每张卵巢组织切片上不同阶段的卵泡个数。卵泡的组织学分类[8]：始基卵泡：单个卵母细胞被扁平的前颗粒细胞部分或完全围绕；初级卵泡：单个卵母细胞被单层立方形的颗粒细胞包围，外周绕以一层扁平卵泡膜细胞；次级卵泡：单个卵母细胞被一层以上颗粒细胞包绕，未出现卵泡腔；窦状卵泡：存在卵泡腔并可见卵丘颗粒细胞。

1.3.5 血清雌二醇、卵泡刺激素浓度检测 在建模前及建模完成后第1、15、30、45天剪尾取血通过Elisa法检测雌二醇（estradiol，E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平的变化。

1.3.6 Western blot分析 实验所得大鼠另一侧卵巢在-80℃冰箱保存，用于Western blot分析。常规方法提取卵巢组织总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至硝酸纤维（NC） 膜上，用质量分数为5%的BSA/脱脂牛奶封闭NC 膜1 h，加入一抗[Sirt1、Cleaved Caspase 3或β-actin（抗体）∶V（TBS）=1∶1000稀释于TBS中] 4℃过夜；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG 二抗（1∶2000稀释），室温下缓慢振荡2 h；最后用化學发光试剂盒显色、曝光，用图像分析软件对蛋白条带作灰度扫描分析，β-actin 作为内参。

1.4统计学处理

采用SPSS16.0统计分析软件，计量资料以均数±标准差表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠体重和动情周期变化比较

为评估化疗及紫铆因对大鼠体重的影响，每5天测量大鼠体重1次并记录。实验前各组大鼠体重无统计学差异。实验过程中对照组平均体重逐渐缓慢升高，由建模前的（277.0±2.6）g增加到第45天的（309.0±1.0）g；化疗组在建模阶段体重呈进行性下降，由建模前的（276.3±3.2）g降至第15天的（260.0±3.0）g，之后逐渐缓慢升高，第45天体重为（283.7±3.5）g，较对照组显著降低（P<0.05）；联合治疗组第45天体重为（300.5±1.2）g，显著高于化疗组（P<0.05）（表1）。

正常大鼠动情周期4～5 d，其中动情前期17～21 h，动情期9～15 h，动情后期10～14 h和动情间期60～70 h[9]。对照组和联合治疗组大鼠在整个观察期监测阴道脱落细胞涂片可见正常的动情周期，仍然存在动情前期、动情期、动情后期及动情间期4个明显时期；化疗组大鼠可见动情周期紊乱，动情期缩短甚至消失，为持续性的动情间期。

2.2四组大鼠卵泡数量、卵巢质量及卵巢组织形态学改变比较

各组大鼠在喂养45 d后，取大鼠双侧卵巢并称重。结果显示，化疗组大鼠卵巢平均质量显著小于对照组（P<0.05），而联合治疗组卵巢质量较化疗组显著增加（P<0.05）（表2），紫铆因组与对照组相比无显著差异。

在第45天处死大鼠的卵巢中，对照组可见各级正常卵泡，且始基卵泡、初级卵泡多见，颗粒细胞多且排列整齐；化疗组卵巢结构破坏，始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡均少于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05），可见大量闭锁卵泡，颗粒细胞黄素化、排列紊乱；联合治疗组及紫铆因组可见各级正常卵泡，闭锁卵泡少（表2、图1）。

2.3 四组大鼠血清雌二醇（E2）和卵泡刺激素（FSH）浓度比较

本研究测定的大鼠动情间期的血清E2和FSH水平相当于基础的E2和FSH水平。给药前，各组血清E2和FSH水平无统计学差异（P>0.05）。

给药期间，对照组和紫铆因组E2水平呈正常波动，化疗组大鼠的血清E2于第15天时明显下降，此后再波动，第45天显著低于对照组（P<0.05）；联合治疗组大鼠的血清E2于第15天低于对照组，但显著高于化疗组（P<0.05），此后逐渐回归，第45天E2值与对照组无差异（表3）。

给药期间，对照组和紫铆因组FSH水平呈正常波动，化疗组大鼠的血清FSH于第15天时达最高峰，显著高于对照组（P<0.05），此后在高水平波动，第45天仍显著高于对照组（P<0.05）；联合治疗组大鼠的血清FSH显著低于化疗组（P<0.05）（表4）。

2.4 Sirt1和Cleaved Caspase 3 蛋白在大鼠卵巢组织中的表达水平

Western blot检测结果显示（图2、表5），各实验组Sirt1蛋白和Cleaved Caspase 3蛋白表达水平存在显著差异（F=345.0，P<0.05；F=98.7，P<0.05）。化疗组大鼠卵巢Sirt1蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05），联合治疗组及紫铆因组Sirt1蛋白表达水平显著高于对照组及化疗组（P<0.05）。化疗组大鼠卵巢Cleaved Caspase 3蛋白表达水平显著高于对照组和联合治疗组（P<0.05）。

3讨论

化疗药物的应用使得各种肿瘤和免疫性疾病治愈率得到提高的同时，所带来的并发症越来越多，因此受到临床医师的重视。卵巢作为化疗药物毒性作用的一个特殊靶器官，暴露于必须的化疗可使卵巢功能遭到不同程度损害，出现月经失调、轻重不等的卵巢功能衰竭，甚至导致不孕不育，严重影响年轻妇女的生活质量和自信心[10]。研究显示，64%的成年女性患者经历肿瘤治疗后伴随至少一项卵巢功能衰竭的症状[11]。因此，探寻化疗对卵巢功能损害的对策成为近年的研究热点，如促性腺激素释放激素类似物（Gonadotropin-releasing-hormone analogues，GnRHa）的应用[12，13]，但费用高昂；还有学者提出组织冷冻保存-自体移植（Cryopreservation-autotransplantation）方面[14]，组织冷冻保存-自体移植存在技术性、安全性，甚至伦理性问题需要进一步解决，适用范畴较为局限，目前尚未临床推广应用，故寻找一种安全有效的方法使化疗药物的卵巢损伤降到最低成为当务之急。

紫铆因主要从腰果树、降香黄檀和漆树中提取，是一种查尔酮类物，对机体抗氧化、抗炎症及抗新生血管活性等多个方面起重要调节作用[15，16]。但紫铆因对卵巢功能的作用，尤其对化疗损伤卵巢功能的影响并未有报道。有学者认为化疗对卵巢功能的损伤主要反映在卵巢储备功能的下降，而反映卵巢储备功能的直接指标是卵泡的数量，间接指标有基础FSH和E2。本研究以客观指标证实紫铆因能有效改善化疗所致的卵巢功能下降并阐明其作用机制。

3.1 紫铆因干预化疗对卵巢重量及卵泡数量的影响

有研究对化疗患者的卵巢组织取活检后发现卵巢萎缩、体积变小，卵巢的各级卵泡数均减少，特别是初级和次级生长卵泡的减少最明显，甚至出现无卵泡卵巢[17]。本实验结果发现与对照组相比，化疗组的卵巢重量、始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡均减少，可见大量闭锁卵泡，颗粒细胞黄素化、排列紊乱，表明化疗可导致卵巢结构破壞，引起卵巢早衰。相反，化疗联合紫铆因联合治疗组可见各级正常卵泡，且始基卵泡、初级卵泡多见，颗粒细胞多且排列整齐，推测紫铆因可改善化疗对卵巢大体和结构的损伤。

3.2 紫铆因干预化疗对卵巢内分泌功能损害的作用

化疗药物致女性性腺功能破坏的常见结局是卵巢早衰，性激素水平的结果常见有FSH显著升高，E2水平低下[18]。本实验结果显示化疗组血清E2显著低于对照组和联合治疗组，血清FSH显著高于对照组和联合治疗组，提示化疗对卵巢内分泌功能有一定的损害作用，而紫铆因干预能减少化疗所导致的卵巢内分泌功能的损害，究其原因可能是化疗药物破坏卵泡正常结构、减少卵泡数量，使性激素分泌减少，继而反馈性引起促性腺激素释放激素的分泌增加，而紫铆因干预能保存卵泡正常结构，改善受损的卵巢功能，恢复正常性激素分泌。

3.3 紫铆因改善化疗损伤卵巢功能的作用机制

卵巢颗粒细胞包绕着卵母细胞，在卵泡发育过程中起着支持、营养卵母细胞的功能，从而确保卵泡发育、排卵、卵子受精和胚胎发育。化疗导致卵巢功能损伤的主导途径可能是启动了细胞凋亡[19]。研究证实早期卵泡的卵细胞发生凋亡，从而导致卵泡闭锁和丢失；晚期生长卵泡由于颗粒细胞凋亡而发生卵泡闭锁。受化疗药物影响，卵泡内的一些特定的信号被激活而促使细胞发生凋亡，抑制此过程就有可能抑制凋亡，从而保护卵巢功能，这为保护女性肿瘤患者化疗后卵巢功能和生殖能力提供了新的途径。

本研究观察成年雌性大鼠在化疗和紫铆因干预下卵巢Sirt1 及促凋亡蛋白Cleaved Caspase 3的表达水平。结果显示，化疗组Sirt1蛋白的表达相对于对照组明显降低，而联合紫铆因治疗组Sirt1蛋白水平比对照组显著增高。既往研究提示，紫铆因是Sirt1的激活剂[6]，而Sirt1是寿命延长效应的关键因子。对Sirt1转基因小鼠研究发现其性成熟延迟而Sirt1基因缺陷小鼠不能生育[20]。由此可见Sirt1对卵巢功能有着重要作用。与对照组相比，化疗组的卵巢Cleaved Caspase 3蛋白表达明显增高，表明化疗对卵巢功能的损伤；而化疗联合紫铆因治疗能显著下调Cleaved Caspase 3 蛋白表达，起到调控卵巢颗粒细胞凋亡的作用。本研究结果显示，Sirt1能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。因此推测，紫铆因可能通过激活Sirt1，抑制细胞凋亡，从而实现对化疗损伤卵巢功能的改善。

综上所述，紫铆因可以改善化疗对大鼠卵巢功能的损害，其作用机制可能与激活Sirt1、增加Sirt1表达、抑制细胞凋亡、维持卵泡池储备相关。本研究为临床肿瘤治疗和免疫性疾病中应用大剂量化疗药物后卵巢功能保护的药物开发提供新的思路。

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（收稿日期：2016-09-16）