PGRMC1在三阴性乳腺癌中的表达及其与ki—67的相关性

杨华锋　纪术峰　李占文　钟镇铧　史国军　范凤凤　唐鲁兵

[摘要] 目的 探討PGRMC1与三阴性乳腺癌（TNBC）分期、分级等各临床病理指标的相关性，建立患者随访系统，并分析其与肿瘤增殖性抗原ki-67的相关性。 方法 利用免疫组化检测90例TNBC患者组织中PGRMC1和ki-67的表达，应用χ2检验，用 Kaplan-Meier方法分析PGRMC1表达与生存情况，Log-rank检验比较生存率，用相关性分析和ROC曲线探索其内在相关性。 结果 90例TNBC组织中PGRMC1呈现高表达50例。PGRMC1的表达与肿瘤的体积、ki-67的表达、淋巴结转移和临床分期相关（P<0.05）；TNBC组织中PGRMC1与年龄和肿瘤病理分级无关（P>0.05）。TNBC组织中PGRMC1的表达与患者的总生存率（Log-rank=15.614，P=0.0001）和无瘤生存率（Log-rank=14.371，P=0.031）密切相关。 结论 TNBC组织中PGRMC1的表达水平与肿瘤转移、临床分期以及ki-67的增殖呈正相关，多因素分析结果提示PGRMC1可作为TNBC的潜在肿瘤生物标志物以及癌干细胞的治疗靶标。

[关键词] 三阴性乳腺癌；PGRMC1；ki-67；靶向

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）34-0008-05

Expression of PGRMC1 in triple negative breast cancer and its correlation with ki-67

YANG Huafeng1 JI Shufeng2 LI Zhanwen1 ZHONG Zhenhua1 SHI Guojun3 FAN Fengfeng1 TANG Lubing1

1.Department of Breast Surgery， the Affiliated Hospital of School of Medicine of Ningbo University， Ningbo 315000， China； 2.Department of General Surgery， Zhujiang Hospital of Southern Medical University， Guangzhou 510282， China； 3.Department of Oncology， Ningbo Hosptial of TCM， Ningbo 315012， China

[Abstract] Objective To explore the correlation between PGRMC1 and TNBC staging and grading and other clinicopathological indicators， establish a patient follow-up system， and analyze its correlation with tumor proliferating antigen ki-67. Methods The expression of PGRMC1 and ki-67 in 90 cases of TNBC was detected by immunohistochemistry. The Kaplan-Meier method was used to analyze the expression and survival of PGRMC1 by χ2 test. Log-rank test was used to compare the survival rate， and the relativity analysis and ROC curve were used to explore the intrinsic correlation. Results In 90 cases of TNBC tissues， PGRMC1 was expressed highly in 50 cases. The expression of PGRMC1 was closely related to tumor volume， ki-67 expression， lymph node metastasis and clinical staging（P<0.05）； there was no correlation between PGRMC1 and age and tumor pathological grade in TNBC tissues（P>0.05）. The expression of PGRMC1 in TNBC tissues was closely related to the tumor-free survival rate（Log-rank=14.371， P=0.031） and overall survival rate（Log-rank=15.614， P=0.0001）. Conclusion The expression level of PGRMC1 in TNBC tissues is positively correlated with tumor metastasis， clinical staging and proliferation of ki-67. Multivariate analysis indicates that PGRMC1 can be a potential tumor biomarker for TNBC and a therapeutic target for cancer stem cells.

[Key words] Triple negative breast cancer； PGRMC1； ki-67； Target

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）患者约占乳腺癌人群的10%～24%，患者发病年龄小，淋巴结阳性率和组织学分级较高，临床行为更具有侵袭性，局部复发和内脏转移率高，预后最差，缓解期最短，平均42.3個月[1]。由于三阴性乳腺癌既缺乏内分泌治疗受体又缺乏靶向治疗，目前尚无针对三阴性乳腺癌的个体化的治疗方案，这就使得其成为临床生存期最短的乳腺癌。此前很多学者研究认为雌激素受体和孕激素受体为细胞内受体，而最近大量基础研究和临床研究发现，在很多组织的细胞膜上有孕激素结合位点，被称之为孕激素膜受体（progesterone receptor membrane component，PGRMC1）[2]。PGRMC1参与孕激素抗正常颗粒细胞凋亡的调控，PGRMC与三阴性乳腺癌的发生、发展及预后是否有相关性？本课题通过对90例三阴性乳腺癌患者PGRMC1的表达情况进行回顾性分析，利用不同的统计学方法探索PGRMC的表达水平与病理分级、临床分期、淋巴结转移情况以及与肿瘤增殖性抗原ki-67表达等临床病理指标之间的关系。探讨PGRMC1作为三阴性乳腺癌的潜在肿瘤生物标志物，以及癌干细胞的治疗靶标的可行性，为三阴性乳腺癌治疗需找新的路径。

1 对象与方法

1.1研究对象

选自宁波大学医学院附属宁波妇女儿童医院乳腺外科2012年1月～2015年12月住院的三阴性乳腺癌患者的石蜡标本（经病理证实），入组患者共90例，年龄27～70岁，平均年龄（45.6土6.5）岁，入组患者均为女性，所有患者术前未进行相关的治疗，术后给予标准的化疗各8周期。病例资料和随访资料完整。病理分级依据WHO分级标准分为：高分化（G1）、中分化（G2）、低分化（G3）。临床病理分期根据2009年公布的UICC新PTNM分期标准分为：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。

1.2 主要试剂

无水乙醇、二甲苯、切片石蜡、40%甲醛、30%双氧水，购于广州市化学工业公司；DAB显色试剂盒、阳性白片、SABC免疫组化试剂盒（即用型）、EnVision检测试剂盒（即用型），购于武汉博士德生物工程有限公司；苏木素、伊红、多聚赖氨酸磷酸二氢钠、枸橼酸钠中性树脂，购于北京中山生物有限公司；PGRMC1羊抗人多克隆抗体购于Abcom公司；ki-67鼠抗人单克隆抗体购于Dako公司；S-P试剂盒（KIT-9710）购自福州迈新公司（即用型）。

1.3 PGRMC1的免疫组织化学染色及评估

标本的石蜡切片60℃烘烤30 min，常规脱蜡、梯度脱水水化后，室温条件下，灭活内源性过氧化物酶10 min。滴加山羊血清封闭液15 min，微波炉加热，常温下加入抗原修复液修复抗原，15 min后再加入1：200稀释的一抗，4℃条件下湿盒反应8 h，37℃复温20 min后PBS洗涤，然后每张贴片滴加生物素化二抗（兔抗人），室温湿盒反应45 min，PBS洗涤后，室温下加入显色剂DAB，根据镜下观察显色信息停止显色剂反应，苏木素复染核，脱水，透明，封片。孕激素膜受体阳性表达的判定：每张切片在高倍镜视野下随机选择5个有代表性区域，进行视野内肿瘤细胞计数。然后再低倍镜下观察阳性细胞的着色强度，利用半定量积分法，对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度分别进行分级计分，然后根据两项之积的平均数定其阳性强度。孕激素膜受体阳性表达的判定标准：在胞浆中染色以棕黄色颗粒为主要成分为阳性表达。胞浆中颗粒染色强弱评判：无棕黄颗粒显色为0分，棕黄颗粒显色细胞<1/3为1分，棕黄颗粒显色细胞为1/3～2/3为2分，棕黄颗粒显色细胞>2/3为3分；再按棕黄颗粒显色细胞所占比评判：棕黄颗粒显色细胞<5%为0分，棕黄颗粒显色细胞介于5%～25%之间为1分，棕黄颗粒显色细胞介于26%～50%之间为2分，棕黄颗粒显色细胞介于51%～75%之间为3分，棕黄颗粒显色细胞>75%为4分。PGRMC1染色强度与阳性细胞百分比的乘积≤1分为阴性，PGRMC1染色强度与阳性细胞百分比的乘积>1分为阳性。

1.4 ki-67免疫组织化学染色及评估

标本的石蜡切片常规脱蜡、梯度脱水水化后，严格按照ki-67免疫组织化学操作程序说明进行，切片中ki-67阳性表达的判定：上皮细胞核中呈现黄色或棕黄色颗粒染色为阳性表达，按任意5个高倍镜视野中得阳性细胞数所占细胞总数比率的平均值并参照文献资料[3]进行分类：阴性：阳性细胞数<3%；阳性：阳性细胞数14%～50%；强阳性：阳性细胞数>50%。

1.5统计学方法

选用SPSS 19.0版统计学软件分析各组临床数据。用Fisher确切概率法分析TNBC临床计数资料和孕激素膜受体的阳性表达，用χ2检验判断分析孕激素膜受体的表达与临床病理指标的关系，采用Kaplan-Meier法分析患者生存情况，用Log-rank检验分析比较患者的生存率。PGRMC1与ki-67关系采用相关性分析及ROC曲线分析。

2 结果

2.1 TNBC组织中PGRMC1、ki-67的表达

90例TNBC组织标本中，PGRMC1阴性表达为40例，50例为阳性表达。镜下在肿瘤细胞胞浆内可见棕黄色颗粒状染色，PGRMC1在正常乳腺组织不表达。ki-67阴性表达25例（27.8%），阳性表达为65例（72.2%）。阳性表达主要以肿瘤细胞上皮细胞核内有棕黄色颗粒（封三图3）。

2.2 TNBC组织中PGRMC1的表达及其与临床病理指标的关系

本组计数资料和等级资料经过统计学分析发现：患者年龄（P=0.193）与TNBC组织中PGRMC1的表达没有相关性，而PGRMC1的表达与淋巴结的转移情况密切相关（P=0.003），PGRMC1的表达与肿瘤病理分级和肿瘤的临床分期并不一致，与肿瘤的病理分级无关（P=0.125），但与肿瘤的临床分期密切相关（P=0.027）；而PGRMC1的表达肿瘤体积（P=0.020）紧密相关，有统计学意义（表1）。

2.3 TNBC患者PGRMC1表达的生存曲线图

本组临床资料经Kaplan-Meier分析结果显示：PGRMC1的表达与患者无瘤生存率有统计学意义[Log-rank（Mantel-cox）=14.371，P=0.031]，PGRMC1的表达与患者总生存率有統计学意义[Log-rank（Mantel-cox）=15.614，P=0.001]，TNBC组织中PGRMC1的表达与患者的无瘤生存率及总生存率密切相关。多因素分析结果提示PGRMC1是TNBC独立的肿瘤生物标志物（P=0.001）（图1）。

2.4 三阴性乳腺癌组织中PGRMC1和ki-67表达及相关性

2.4.1 TNBC组织中PGRMCI和ki-67的表达情况 统计结果显示（表2）：PGRMC1组：阳性表达占55.6%，阴性表达占44.4%；阳性表达组与阴性表达组之间比较差异有统计学意义（P<0.01）；阳性表达主要以高表达为主，与低中阳性表达组比较差异有统计学意义（P<0.01）。ki-67组：阳性表达占72.2%，阴性表达占27.8%；阳性表达组与阴性表达组之间比较差异有统计学意义（P<0.01）；阳性表达主要以高表达为主，与低中阳性表达组比较差异有统计学意义（P<0.01）。

2.4.2 三阴性乳腺癌PGRMCI与Ki-67表达的相关性分析 相关性统计分析结果显示：三阴性乳腺癌PGRMCI与ki-67的表达呈显著的正相关（r=0.622，P=0.000）。

2.4.3 诊断特征曲线对PGRMC1和ki-67诊断三阴性乳腺癌的评价与比较 曲线图显示（图2）：PGRMCI与ki-67的ROC曲线均位于标准参考线的上方，远离标准参考线，两条曲线近乎重叠，说明PGRMCI与ki-67对三阴性乳腺癌的诊断敏感性基本接近，而且诊断的敏感性比较高。统计结果提示：PGRMCI的ROC曲线下面积为0.558，面积标准误为0.064；ki-67的ROC曲线下面积为0.567，面积标准误为0.064；两组曲线面积无统计学差异（P>0.05）。提示两个指标诊断价值等同。

3 讨论

激素信号通路是能将细胞外具有蛋白活性的分子信号传入细胞内发挥效应的一系列酶促反应的通路，外在因素和条件下导致激素信号通路的异常激活，从而引起一系列的差异信号传导，诱导引起异常的物质代谢，异常活化后的信号通路及由此引起的异常的物质代谢可能在乳腺癌的发生、发展和转归过程中起重要作用[4，5]。三阴性乳腺癌分子表达为ER-/PR-/HER-，组织学分级差、预后差，内分泌治疗基本无效，以往研究认为ER、PR为胞内受体，近年来研究发现PGRMC1作为一种新型的膜受体在多种组织都有表达[6]，可以特异性结合雌、孕激素，该受体与肿瘤细胞增殖，转移以及转归密切相关[7-9]，孕激素通过受体结构中C末端的70-130氨基酸的位点结合，研究发现沉默PGRMC1基因的表达，肿瘤细胞的分裂和增殖受到明显抑制[10]，PGRMC1能影响3-H孕激素入胞率，导致孕激素介导的滋养细胞抗凋亡功能丧失[11，12]。以往的研究发现该受体为阿片类受体，但是他又与经典的阿片类受体不具有同源性，而与细胞色素b5有高度的同源性，PGRMC1分子结构上具有细胞色素b5配体结合位点，可与血红素Hemel分子结合而成为具有多功能活性的靶蛋白。很多实验和临床研究已经证实PGRMC1与乳腺癌发生发展及预后关系密切[13-16]。而对三阴性乳腺癌发生、发展与PGRMC1有无内在的相关性方面的研究资料很少，本研究试图通过分析其肿瘤预后相关的诸多病理指标和生物因子之间内在的相关性，以探索其内在联系。

ki-67是近年来在乳腺癌的发生发展过程中“明星”因子，日益受到临床医生高度重视，其本质是一种肿瘤增殖相关的核抗原蛋白，组织结构由两条345kd、395kd的多肽链组成。在细胞的有丝分裂周期中发挥重要生理作用，细胞有丝分裂G1期后半期出现，M期达到锋值，而之后迅速降解而失活。研究发现[17-20]ki-67高表达的乳腺癌患者，肿瘤细胞增殖活跃，肿瘤的生物学行为较差，生长速度快侵袭性大，恶性程度高，易发生肿瘤复发和远处转移，患者预后一般都比较差。研究发现[3]，ki-67在正常乳腺组织也有极低水平的表达，阳性细胞数目比率基本都<3%以下。

目前临床上判断乳腺癌预后的方法和指标很多：包括常规的评估乳腺癌预后的临床病理指标、激素受体表达状况、her-2表达情况、乳腺癌危险因子预测模型等，但是肿瘤的异形性和异质性决定了现行的预测手段无法理想地判断预后，进而无法取得满意的疗效，从而导致肿瘤早期出现复发转移，患者生存质量下降和生存时间缩短。本课题研究发现ki-67与PGRMC1在三阴性乳腺癌的表达呈正相关，在三阴性乳腺癌的表达中阴性、阳性、强阳性表达的趋势基本一致，二者在三阴性乳腺癌中均为高表达。诊断特征曲线对PGRMC1和ki-67诊断三阴性乳腺癌敏感度也是基本接近，有较高的敏感度。那么两者之间是否存在内在的必然的联系，目前有关这方面的研究很少[21]，是否存在PGRMC1结合胞浆游离雌、孕激素而激活下游基因从而引起ki-67的高表达？那么敲除PGRMC1基因后ki-67增殖活性降低？从而降低肿瘤的侵袭性。ki-67在有丝分裂周期中需要经过磷酸化和去磷酸化然后才能降解，双肽链的结构或可提示我们ki-67表达可能受蛋白酶旁路调控。PGRMC1能激活细胞内的Akt激酶，从而引起Akt的磷酸化。由此可以推测PGRMC1作为一种活性转换蛋白直接参与细胞信号转导通路活化。活化的Akt参与了ki-67磷酸化，从而干预有丝分裂的进程。本临床研究只是发现了此规律，要揭示这些真相有待后续的基础研究进行验证和考量。

既往研究证实PGRMC1既具有孕激素受体功用，同时也具有雌激素受体的效能，在乳腺癌发展途中雌激素受体阴性的乳腺癌有着更强的侵袭性，以及与雌激素受体阳性的乳腺癌有着不同的代谢通路和模式。因此，PGRMC1作为雌激素的负向调节蛋白，在三阴性乳腺癌的发生、发展及转归中起着重要的作用，可能成为三阴性乳腺癌治疗的新靶点。本课题分析了PGRMC1和ki-67在正常乳腺组织及三阴性乳腺癌组织中的表达情况，结果发现PGRMC1在三阴性乳腺癌中呈现高表达，同时发现PGRMC1阳性表达在三阴性乳腺癌组织中呈现不均衡性，强弱不等，不同组织切片中PGRMC1表达有差异，同时发现同一张组织切片PGRMC1表达在不同区域颗粒着色不均一。进而探索分析TNBC组织中PGRMC1的表达与临床病理指标和ki-67之间的关系。结果发现TNBC组织中PGRMC1的表达与肿瘤的生物学行为、总体生存率、无瘤生存率以及ki-67的表达呈正相关性；多因素统计分析结果提示PGRMC1可作为三阴性乳腺癌的潜在肿瘤生物标志物，以及癌干细胞的治疗靶标（P=0.002）。

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（收稿日期：2016-08-19）