两株芽孢杆菌混菌发酵产芽孢条件的优化

王继雯，岳丹丹，赵俊杰，刘莉，慕琦，李冠杰，甄静，巩涛，杨文玲，杜志敏，陈国参*

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州450008；2.河南省微生物工程重点实验室，河南郑州450008）

两株芽孢杆菌混菌发酵产芽孢条件的优化

王继雯1，2，岳丹丹1，2，赵俊杰1，2，刘莉1，2，慕琦1，李冠杰1，2，甄静1，2，巩涛1，2，杨文玲1，2，杜志敏1，2，陈国参1，2*

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州450008；2.河南省微生物工程重点实验室，河南郑州450008）

为了探索地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）DY-1和胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）XK混菌发酵产芽孢的最佳条件，该研究采用单因素试验和正交试验进行了优化；利用Eppendorf 7.5 L发酵罐在最佳条件下进行了混菌发酵产芽孢试验。结果表明，混菌发酵产芽孢的最佳发酵条件为：胶冻样芽孢杆菌XK和地衣芽孢杆菌DY-1种子液的接种比例为4∶1（V/V），培养温度37℃，培养时间60 h，pH 8.0。在此条件下，进行Eppendorf 7.5 L发酵罐混菌发酵试验，其芽孢数可高达1.1×1011CFU/mL，高于摇瓶发酵所产芽孢数（2.0×1010CFU/mL）。

地衣芽孢杆菌混菌发酵DY-1；胶冻样芽孢杆菌XK；产芽孢条件；正交试验

WANG Jiwen1,2,YUE Dandan1,2,ZHAO Junjie1,2,LIU Li1,2,MU Qi1,LI Guanjie1,2,ZHEN Jing1,2,GONG Tao1,2, YANG Wenling1,2,DU Zhimin1,2,CHEN Guocan1,2*
(1.Henan Academy of Sciences Institute of Biology Co.,Ltd.,Zhengzhou 450008,China; 2.Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province,Zhengzhou 450008,China)

混菌发酵又称混合发酵，指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术[1]。混菌发酵是纯种发酵技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术[2]。优点是可提高发酵效率甚至可形成新产品，与单菌株发酵相比显著缩短了发酵时间[3]。在我国现代发酵工业中，设计构建的指定菌种的多菌种混合发酵并不多见，但在食品发酵、环境保护和能源方面已有了一些研究和应用[3-5]。微生物混菌培养在很多领域中的作用已经得到充分肯定，部分成果已成功应用于实践[6-8]。随着混菌发酵在各方面应用研究的深入，在生物菌肥方面混菌发酵的研究也已成为热点[9-11]。混菌优化培养，不但可以提高发酵效率，节约生产成本，而且由它们制得的高密度芽孢菌剂或微生物肥料，应用于农业生产，可以减少化肥用量，缓解土壤污染，为中国的粮食安全保驾护航。

芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体，它的形成受营养物质和环境因素等的综合影响[12]。芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。自由存在的芽孢没有明显的代谢作用，只保持潜在的萌发力，称为隐藏的生命。一旦环境条件合适，芽孢便可以萌发成营养细胞。一般认为，芽孢是在生长后期、营养物质缺乏时形成的，因而是适应不良环境的产物。但实际上，可能不完全是如此。有研究人员在培养枯草芽孢杆菌时，曾作过追踪观察，结果发现，在接芽孢种培养4 h后即有芽孢生成；以后每隔4 h观察一次，芽孢数均呈比例增长；至24 h时，约半数产生芽孢；48 h后，全部变成芽孢，表明在此情形下营养细胞转向芽孢形成有一定的概率，芽孢开始形成不必等到生长后期，更不必等到生长完全停止[13]。一般情况下，当菌体处于不利条件时才产生芽孢，如果营养条件太差，虽然芽孢形成率高，但芽孢总数过低；营养条件过好时，虽有利于菌体生长但不易形成芽孢，在短时间内无法达到高芽孢形成率。所以进行产芽孢条件研究非常必要[14]。因此，本研究以无拮抗反应的并具有解磷解钾作用的促生菌株地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）DY-1和胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）XK为混菌发酵研究对象，采用单因素试验和正交试验对这两株混菌发酵的最佳产芽孢的条件进行优化，以期为工业化发酵生产和复合微生物肥料的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）DY-1和胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）XK：河南省科学院生物研究所保藏菌种。

1.1.2 培养基

YMA液体培养基：甘露醇10 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，NaCl0.1g/L，CaSO40.2g/L，Rh微量元素液4 mL/L（Rh微量元素液：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L），pH 6.8～7.0.

混菌发酵培养基：可溶性淀粉5g/L，豆粕0.75g/L，KNO30.75g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，NaCl0.1g/L，MnSO4·2H2O 0.25g/L，FeSO4·7H2O0.25g/L，CaSO40.2g/L，Rh微量元素液4 mL/L，pH 7.0～8.0。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂粉5 g，用5 mol/L NaOH溶液调pH至7.0，用去离子水定容至1 L。

硅酸盐细菌摇瓶固体培养基：淀粉5.0g，酵母浸粉1 g，K2HPO42.0 g，MgSO40.5 g，CaCO30.1g，FeCl35 mg，琼脂粉5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 仪器与设备

JA1103N电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；EMS-4A磁力搅拌器：上海鹰迪仪器设备有限公司；XMTD-8222恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；HYG-A恒温摇床：江苏太仓市实验设备厂；303A-1型恒温培养箱：上海荣丰科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株之间的拮抗试验

地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis）DY-1和胶冻样芽孢杆菌（B.mucilaginosus）XK菌株间的拮抗反应测试采用平板扩散对峙法，将一种菌在液体培养基中培养24 h的菌悬液2%接种到液体YMA发酵培养基中，30℃振荡培养48 h，各取100 μL发酵液分别涂布YMA培养基平板，用打孔器打孔；然后分别将发酵液8 000 r/min离心10 min取上清，取一种菌株的发酵液上清50 μL滴加在涂布有另一种菌株的平板孔中，以无菌水作阴性对照，将2株供试菌两两进行抑菌试验，每个处理做3次重复，置37℃恒温箱中培养24 h后观察有无抑菌圈形成。

1.3.2 单因素试验

将胶冻样芽孢杆菌XK和地衣芽孢杆菌DY-1种子液分别按一定接种比例以适当的接种量接种于混菌发酵培养基中，置于180 r/min摇床上恒温培养一定时间后，取发酵液1 mL，80℃水浴20 min，将发酵液按101～106倍比稀释后，取104、105、106涂布于LB平板，37℃培养24h后芽孢计数。分别考察两种菌的接种比例（1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1（V/V））、接种量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、培养温度（25℃、30℃、35℃、37℃、40℃）、培养基初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、培养时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）对混合发酵培养基产芽孢数的影响。

1.3.3 正交试验

根据单因素试验的结果，以产芽孢数（Y）为评价指标，选择培养温度（A）、初始pH值（B）、胶冻样芽孢杆菌XK∶地衣芽孢杆菌DY-1（C）、培养时间（D）为因素，采用4因素3水平的正交试验对混菌发酵产芽孢条件进行优化，正交试验优化因素与水平见表1。

表1 发酵产芽孢条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for spore-producing conditions optimization

1.3.4 芽孢计数

芽孢计数法参考周德庆[15]所介绍的方法，芽孢平板计数是在80℃水浴加热20 min后采用平板菌落计数法检测芽孢的形成数量。

1.3.5 7.5 L发酵罐中试发酵试验

在最优发酵条件下，利用Eppendorf 7.5 L发酵罐，在设定发酵温度，发酵时间，初始pH值、搅拌速度等发酵参数的条件下进行中试混菌发酵试验。观察记录发酵参数的变化，并用涂布平板计数法进行芽孢计数。

2 结果与分析

2.1 菌株拮抗反应测试

微生物间的拮抗作用，一般是指一种微生物的生命活动或其代谢产物，抑制或干扰另一种微生物生命活动的现象。通过平板对峙试验结果表明，地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）DY-1和胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）XK无拮抗反应，可以进行混菌发酵。

2.2 单因素试验

2.2.1 接种比例对混菌发酵产芽孢的影响

图1 菌株XK与DY-1接种比例对混菌发酵产芽孢的影响Fig.1 Effect of inoculation proportion of strain XK and DY-1 on spore production by mixed bacteria fermentation

由图1可知，不同接种比例对芽孢数的影响比较大，当胶冻样芽孢杆菌XK和地衣芽孢杆菌DY-1种子液的接种比例为4∶1（V/V）时，混菌发酵培养基产芽孢数最多，为9.65×109CFU/mL；随着XK∶DY-1接种比例的增加，混菌发酵培养基产芽孢数开始减少。这可能是因为胶冻样芽孢杆菌XK生长速度较地衣芽孢杆菌慢的缘故。因此，选择胶冻样芽孢杆菌XK和地衣芽孢杆菌DY-1种子液的最佳接种比例为4∶1（V/V）进行正交试验优化。

2.2.2 接种量对混菌发酵产芽孢的影响

图2 接种量对混菌发酵产芽孢的影响Fig.2 Effect of inoculum on spore production by mixed bacteria fermentation

由图2可知，随着接种量的增加，混菌发酵产芽孢数变化不大，这可能是因为接种量增加到一定在程度时，导致单位体积的菌体密度增大，从而影响菌株生长和芽孢的形成。当接种量为5%时，混菌发酵产芽孢最多，为1.13×1010CFU/mL。因此，选择接种量5%为最佳。

2.2.3 培养温度对混菌发酵产芽孢的影响

图3 培养温度对混菌发酵产芽孢的影响Fig.3 Effect of culture temperature on spore production by mixed bacteria fermentation

由图3可知，随着培养温度的升高，混菌发酵产芽孢数迅速增加，这是因为在一定温度范围内，适当提高培养温度能促进菌株的生长和芽孢的形成，当培养温度在35～40℃范围内时，产芽孢较多；当培养温度为37℃时产芽孢最多，为1.23×1010CFU/mL。因此，选择培养温度为37℃进行正交试验优化。

2.2.4 发酵培养基初始pH值对混菌发酵产芽孢的影响

图4 初始pH值对混菌发酵产芽孢的影响Fig.4 Effect of initial pH on spore production by mixed bacteria fermentation

由图4可知，当发酵培养基初始pH值由5.0升高至8.0时，混菌发酵产芽孢数量逐渐增加，当初始pH值为8.0时，产芽孢数最多，为1.12×1010CFU/mL；再继续增加pH值，混菌发酵产芽孢数开始下降，这可能是因为pH值增大，发酵液溶液碱性增强，不利于菌株的生长和芽孢的形成。因此，选择发酵培养基最佳初始pH值为8.0进行正交试验优化。

2.2.5 培养时间对混菌发酵产芽孢的影响

由图5可知，随着发酵时间的延长，混菌发酵产芽孢数也随之增加，当培养时间＞36 h后，芽孢数增加缓慢，当培养时间48 h之后，产芽孢数逐渐趋于稳定，当培养时间为72 h时产芽孢数反而略有所减少，可能是因为随着发酵时间的延长，代谢产物增多和菌株密度过大所致。因此，选择培养时间为48 h进行正交试验优化。

图5 培养时间对混菌发酵产芽孢的影响Fig.5 Effect of culture time on spore production by mixed bacteria fermentation

2.3 培养条件的正交试验

根据单因素试验的结果，接种量对混菌发酵产芽孢数影响不显著，因此选择培养温度（A）、初始pH值（B）、菌株XK∶DY-1接种比例（C）、培养时间（D）4个因素，以产芽孢数（Y）为评价指标，采用正交试验对混菌发酵产芽孢条件进行优化，正交试验优化因素与水平见表2。

表2发酵产芽孢条件优化结果与分析

Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for spore-producing conditions optimization

试验号ABCD芽孢数（/×108CFU·mL-）111111182.0 2122238.0 31333135.5 4213268.5 52213202.0 62321112.0 7312322.5 8323150.5 9331291.5 k1118.5091.00158.50114.80 k2127.5096.8357.5066.00 k354.83113.0084.83120.00 R72.6722.00101.0054.00

由表2可知，极差结果分析显示，影响混菌发酵产芽孢数的因素主次关系为C＞A＞D＞B，即接种比例＞培养温度＞培养时间＞初始pH值。其最优组合为A2B3C1D3，即混菌发酵最佳培养条件为培养温度为37℃，初始pH值为8.0，胶冻样芽孢杆菌XK和地衣芽孢杆菌DY-1种子液的接种比例为4∶1（V/V），培养时间60 h。在此条件下，进行3次验证试验，混菌发酵产芽孢数为2.02×1010CFU/mL。

2.4 7.5 L发酵罐小试

在最优发酵条件下，利用Eppendorf 7.5 L发酵罐进行中试混菌发酵试验，具体发酵参数变化如图6所示，由图6可知，在发酵过程中，发酵罐溶氧（dissolve of oxygen，DO）和发酵液pH值变化较大。在发酵约12 h时，发酵罐溶氧DO开始突然降低，此时的pH值也降低，说明此时菌株开始进入对数生长期；当发酵约16 h后，发酵罐溶氧DO又突然升高，而此时发酵液pH值开始逐渐增加；当发酵约19 h后，溶氧DO达到最低，发酵液pH值又开始逐渐降低，说明混合菌株已经开始进入对数生长后期；当发酵约25 h后，溶氧DO又逐渐升高，发酵液pH值虽有所降低，但变化不大，说明此时混合菌株已经达到生长稳定期，芽孢已经开始形成。通过7.5 L发酵罐小试试验可以清楚地观察到：随着发酵时间的延长，溶氧DO和发酵液pH值等发酵参数的变化，及时了解菌株生长和芽孢形成情况。

图67 .5 L发酵罐中试试验在40 h内各参数的变化Fig.6 Changes of the parameters of 7.5 L fermentor pilot scale tests in 40 h

在发酵60 h后放罐，对混合发酵菌液进行倍比稀释，通过平板计数法计算出混菌发酵液中芽孢总数高达1.09× 1011CFU/mL，远高于摇瓶发酵所产芽孢数（2.02×1010CFU/mL）。

3 结论

本研究通过上述单因素试验和正交试验得出混菌发酵产芽孢最佳条件为胶冻样芽孢杆菌XK和地衣芽孢杆菌DY-1种子液的接种比例4∶1（V/V），培养温度37℃，培养时间60h，pH8.0，在此最佳发酵条件下，利用Eppendorf7.5L发酵罐进行混菌发酵产芽孢，其芽孢数可高达1.09×1011CFU/mL，得出了混菌发酵基本工艺参数的变化规律。采用混菌发酵模式不但可以节约发酵时间，而且还可减低生产成本。从而为工业化发酵生产微生物肥料提供了科学依据。

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TS201.3

0254-5071（2017）05-0095-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.020

2016-12-05

2012年河南省重大科技专项（121100110100）；2014年河南省转制机构研究发展专项[豫财政(2014)383号]；2015年河南省科学院生物研究所有限责任公司/中科院微生物研究所应用微生物技术联合实验室专项基金项目

王继雯（1970-），女，副研究员，硕士，研究方向为农业微生物。

*通讯作者：陈国参（1963-），男，研究员，硕士，研究方向为农业微生物。