替米考星长效混悬剂的研制与质量评价

李明璐，邹本革，毕可东，徐 玉

（1. 青岛农业大学，山东青岛 266109；2. 青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200；）

替米考星长效混悬剂的研制与质量评价

李明璐1，邹本革2，毕可东1，徐 玉1

（1. 青岛农业大学，山东青岛 266109；2. 青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200；）

[目的]利用现代缓释技术，以替米考星为原料药，研制出溶解度较高、疗效强、可减少给药次数的替米考星长效混悬剂，并对其进行质量评价，为该药的批量生产提供可靠依据。[方法]通过正交优化法选择最优处方，并对最优处方进行含量测定试验、稳定性试验和药动学试验。[结果]替米考星长效混悬剂最佳处方为：替米考星原料药2.5g/100 mL，有机溶媒（1，2-丙二醇:乙醇=9:1）占比65%，润湿剂（吐温-80）0.3%，助悬剂（羟丙甲纤维素）5%，抗氧剂（无水亚硫酸钠）0.03%；含量测定结果为合格；影响因素试验发现替米考星长效混悬剂对高温和强光照敏感，对湿度不敏感；加速试验和长期试验发现替米考星长效混悬剂稳定性良好；药动学试验发现替米考星长效混悬剂和实验室自制替米考星溶液的AUC分别为43.164 9 µg·h·mL-1和26.206 5 µg·h·mL-1，替米考星长效混悬剂的相对生物利用度为164.71%。[结论]本试验制得的替米考星长效混悬剂含量合格、稳定性良好、相对生物利用度高，可以批量生产，用于大型养殖场的大规模给药。

替米考星；混悬剂；含量；稳定性；药动学；生物利用度

替米考星是由泰乐菌素半合成的一种大环内酯类抗生素，其抗菌活性强，主要作用于革兰氏阳性菌，对某些革兰氏阴性菌、支原体等也有效。替米考星对胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、畜禽支原体的抗菌活性高，被广泛应用于由敏感菌引起的畜禽肺炎和乳房炎[1-3]。替米考星味极苦，限制了其在预混剂和饮水剂方面的应用，而普通注射液又需要大量的人力频繁给药，不便于大规模养殖场的使用。故本试验利用现代缓释技术，以替米考星为原料药，研制出溶解度较高、疗效强、可减少给药次数的替米考星制剂。

我国在兽药长效制剂方面的研究起步较晚，目前主要有口服缓释制剂、注射用缓释制剂、透皮缓释制剂、植入缓释制剂及其他固体分散体、脂质体、微球、微囊等[4-9]。考虑到替米考星的理化性质及注射用缓释制剂生物利用度高、毒性低、给药方便、起效快等因素，本试验决定制备一种替米考星长效混悬剂。

1 材料

1.1 试验仪器

LC-1000高效液相色谱仪，山东鲁南瑞红化工仪器有限公司生产；KQ5200E超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司生产；DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精密试验设备有限公司生产；BCM-100型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司生产；YP-250GSP综合稳定性试验箱，上海迈捷实验设备有限公司生产。

1.2 试验药品

替 米 考 星 原 料 药（96.3%）， 批 号A20130401，山东齐鲁制药有限公司产品；1,2-丙二醇，批号20141130，天津市博迪化工有限公司产品；无水乙醇，批号20141201，青岛爱得旺化工科技有限公司产品；吐温-80，批号20150302，青岛爱得旺化工科技有限公司产品；羟丙甲纤维素，批号20140822，青岛爱得旺化工科技有限公司产品；无水亚硫酸钠，批号20140707，天津市巴斯夫化工有限公司产品；注射用水，批号20150610，实验室自制；普通营养琼脂，批号20140701，北京陆桥技术有限公司产品；0.9%氯化钠溶液，批号20141118，青岛爱得旺化工科技有限公司产品。

1.3 试验动物

12只体重（4±0.5）kg的成年健康中华田园犬，雌雄各半，购自青岛市城阳区动物市场。试验过程饲喂不含抗生素的全价日粮。

2 方法

2.1 替米考星长效混悬剂处方的筛选与优化

采用单因素法筛选各药物辅料，筛选出4种辅料：机溶媒为（1,2-丙二醇:乙醇=9:1），润湿剂为（吐温-80），助悬剂为（羟丙甲纤维素），抗氧剂为（无水亚硫酸钠）。根据上述筛选结果，选定溶媒、润湿剂、助悬剂、抗氧化剂4个因素，每个因素3个水平，进行正交试验，按L9（34）正交表设计实验。按正交表所列处方分别制备20 mL 25%替米考星长效混悬剂9份，过滤、灭菌后进行替米考星含量测定试验、重分散性试验和沉降容积比试验。含量变化值要求在2%以内，重分散性次数越少越好，沉降容积比不低于50%，综合考察后选择最优处方。

2.2 含量测定试验

采用高效液相色谱法测定供试替米考星长效混悬剂的含量，共3批，每批2瓶。

2.3 稳定性试验

2.3.1 影响因素试验。包括高温、高湿和强光照射试验[10]。取3批不同批次的供试替米考星长效混悬剂，分别于60 ℃，25 ℃、相对湿度75%，照度为（4 500±500）Lx的条件下放置10天，在第5天和第10天取样，用高效液相色谱法测定其含量、重分散性和沉降容积比。

2.3.2 加速试验。取3批不同批次的供试替米考星长效混悬剂于温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%条件下放置6个月，分别于试验期间的第1、2、3和6个月末取样，用高效液相色谱法测定其含量、重分散性和沉降容积比。

2.3.3 长期试验。取3批不同批次的供试替米考星长效混悬剂于温度（25±2）℃、相对湿度（60±10）%条件下放置12个月，分别于试验期间的第0、3、6、9和12个月末取样，用高效液相色谱法测定其含量、重分散性和沉降容积比。

2.4 药动学试验

选用12只体重（4±0.5）kg的成年健康中华田园犬，随机分为两组，雌雄各半。给药前，取每只犬的空白血浆1 mL作为空白对照。分别将替米考星长效混悬剂和实验室自制替米考星溶液（方法：精密称定磷酸替米考星2.5 g，溶于100 mL注射用水，置于数显恒温磁力搅拌器搅拌至完全溶解，过滤、灭菌得25%磷酸替米考星注射液）以20 mg/ kg.b.w的剂量肌肉注射两组犬。给药后，分别于15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，前臂桡静脉采血2 mL装于有肝素钠的离心管中，3 000 r/min离心20 min，取血浆-20 ℃冷藏备用。

向装有血样的离心管加入4 mL乙腈，充分混匀后，3 000 r/min离心20 min。取上层的含药层，加入适量1 moL/L NaOH溶液至pH=9，使用氯仿提取2次，3 000 r/min离心20 min，合并氯仿层，置于通风橱中挥发至干燥，加入流动相溶解，漩涡震荡1 min，冷藏备用。取样，使用高效液相色谱法检测。

采用WinNonlin软件，对数据进行非房室模型分析，得出药动学参数。

3 结果

3.1 替米考星长效混悬剂处方筛选与优化

根据表1试验结果，以含量为X、重分散性为Y、沉降容积比为Z，进行综合评分。综合得分=X+1/Y+Z。对综合得分进行直观分析，结果见表2。

表1 L9（34）正交试验结果

由表2可知：极差大小顺序为A＞B＞C＞D，表明溶媒比例影响最大，其次是润湿剂和助悬剂，抗氧剂影响最小。其中A因素：K1＜K2＜ K3；B因素：K1＜K2＜K3；C因素：K2＜K1＜K3；D因素：K1＜K3＜K2。由此得出最优处方为A3B3C3D2，即有机溶媒占比为65%，润湿剂占比为0.3%，助悬剂占比为5%，抗氧剂占比为0.03%。

表2 正交试验综合得分

按照最优处方制备样品3批，测定灭菌前后替米考星原料药含量变化值（表3）。结果表明，3批样品灭菌前后含量变化都小于2%，符合标准。且通针性试验结果为易，表明通针性良好。

表3 三批样品含量变化值

3.2 含量测定

含量测定结果（表4）表明，供试品含量变化均小于2%，符合药典规定，检验合格。

表4 供试品含量测定结果

3.3 稳定性试验

高温、高湿和强光照射试验结果表明，在高温试验和强光照射试验中，供试品药物含量稍有下降，重分散次数随取样时间延长而增多，沉降容积比稍有下降；高湿试验中，供试品药物含量几乎不变，重分散次数不随取样时间延长而增多，沉降容积比几乎无变化（表5～7）。综上所述，替米考星长效混悬剂对温度敏感，储存运输时应避免高温；对湿度不敏感；对光敏感，成品包装应具有遮光功能。

表5 高温试验结果

表6 高湿试验结果

表7 强光照射试验结果

加速试验结果表明，供试替米考星长效混悬剂药物含量稍有降低，重分散性次数随时间延长有增多，沉降容积比数值稍有减小，但所有变化均符合兽药典要求（表8）。综上所述，该替米考星长效混悬剂稳定性好。

表8 加速试验结果

长期试验结果表明，供试替米考星长效混悬剂药物含量稍有降低，重分散性次数随时间延长，仅增多1～2次，沉降容积比数值稍有减小，所有变化均符合兽药典要求（表9）。综上所述，该替米考星长效混悬剂稳定性好。

表9 长期试验结果

3.4 药动学试验

对试验犬肌注给药后，替米考星长效混悬剂组和实验室自制替米考星溶液组测得的血药浓度与时间数据见表10，药时曲线见图1。

表10 两种制剂的血药浓度（n=6）

图1 两种制剂血药浓度-时间曲线

结果显示，替米考星长效混悬剂组在2 h达到峰浓度2.285 µg/mL，而实验室自制替米考星溶液组1 h即达到峰浓度2.126 µg/mL，且前者较后者峰浓度高，说明前者较后者在犬体内吸收程度高。替米考星长效混悬剂组在犬体内血药浓度可达96 h，而实验室自制替米考星溶液组在犬体内的血药浓度在72 h时即低于检测限，说明前者较后者在犬体内作用时间长。

WinNonlin软件数据分析结果显示，替米考星长效混悬剂在犬体内的末端消除半衰期为21.839 0 h，而实验室自制替米考星溶液在犬体内的末端消除半衰期为13.605 1 h，表明后者在犬体内的消除速度较前者快；前者的药时曲线下面积为43.164 9 µg· h·mL-1，而后者为26.206 5 µg·h·mL-1，表明前者在犬体内的药物吸收程度较后者高（表11）。

表11 药动学参数

根据下面公式计算得出替米考星长效混悬剂的相对生物利用度为164.71%。

4 讨论

在试验中，有机溶媒使用的是少量乙醇与1,2-丙二醇混合液，目的是提高混悬剂的通针性，而最终选择的比例为1,2-丙二醇:乙醇=9:1，这是因为乙醇肌肉注射时浓度超过10%对组织刺激性较大。

含量测定及稳定性试验的结果中，替米考星含量均在24.95%～24.99%之间，说明制备的混悬剂中替米考星溶解度高，达到了替米考星含量为25%的预期标准，解决了替米考星可溶性差的难题。但由于时间原因，长期试验只进行了12个月。截至第12个月，供试替米考星长效混悬剂含量未见明显减少，重分散性良好，沉降容积比接近于1。若要测得准确有效期，还需继续观察。

药动学试验结果表明，本试验制得的替米考星长效混悬剂在犬体内的血药时间延长，生物利用度提高。其原因在于试剂配方中的羟丙甲纤维素具有助悬和缓释作用，既提高了难溶性药物替米考星的溶解度，又延缓了替米考星的扩散溶出，达到了长效治疗的目的。

5 结论

本试验确定了替米考星长效混悬剂的最优处方为：替米考星原料药2.5g，有机溶媒（1,2-丙二醇：乙醇=9:1）65%，润湿剂0.3%，助悬剂5%，抗氧化剂0.03%，注射用水至全量100 mL。经制剂的含量测定试验、稳定性试验和药动学试验，证明其质量合格。

[1]刘晓萍，赵恒寿. 替米考星的研究进展及其应用[J]. 四川畜牧兽医，2008，35（4）：33-34.

[2]宋福杰，刘明春，符特. 替米考星的应用研究进展[J]. 现代畜牧兽医，2006（7）：63-65.

[3] AYLING R D，BAKER S E，NICHOLAS R A，et al. Comparison of in vitro activity of danofloxacin，florfenicol，oxytetracycline，spectinomycin and tilmicosin against Mycoplasma mycoides subspecies mycoides small colony type[J].Veterinary Record，2000，146（9）：243-246.

[4]柴晖丽，乔赛毛措，周毛加. 浅谈兽药缓控释制剂的研究进展[J]. 青海畜牧兽医杂志，2014， 44（3）：40-42.

[5]王艳玲，刘晨光，郝智慧. 兽药缓控释制剂的研究进展[J]. 中国兽药杂志，2008，42（11）：42-46.

[6] DEWEY D，LEE H J，MARSTON H R. Provision of cobalt to ruminants by means of heavy pellets[J]. Nature，1958，181（4620）：1367-1371.

[7] ROBISON J R. Sustained and Controlled Release Drug Delivery System[M]. New York：Marcel Dekker，1978.

[8] ANDERSON N. Controlled release technology for the control of helminths in ruminants[J]. Vet Parasitol，1985，18（1）：59-66.

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（责任编辑：朱迪国）

Preparation and Quality Evaluation of Tilmicosin Long-action Suspension

Li Minglu1，Zou Benge2，Bi Kedong1，Xu Yu1

（1. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shangdong 266109；2. Haidu College of Qingdao Agricultural University，Laiyang，Shangdong 265200）

[Objective]In order to develop the Tilmicosin long-action suspension with characteristics of high solubility，good curative effect and low administration frequency by using modern slow-release technology and taking Tilmicosin ingredient as raw materials，so as to provide reliable basis for mass production on the basis of preliminary quality evaluation.[Methods]Choosing the optimal prescription through orthogonal optimization method，then content determination，stability and pharmacokinetic tests were conducted towards the optimized prescription. [Results]The proportions of the prescription for the Tilmicosin long-action suspension listed below：Tilmicosin ingredients（2.5 g/100 mL），Organic solvent（1,2-propylene glycol:ethanol = 9:1）accounting for 65%，Wetting agent（Twain-80）accounting for 0.3%，Suspended aid（Hydroxypropyl methyl cellulose）accounting for 5%，and Antioxidant（Anhydrous sodium sulfite）accounting for 0.03%. Results of content determination test manifested as qualified. Sensitivity test showed Tilmicosin long-action suspension was sensitive to high temperature and strong light，but it wasn´t humidity-sensitive. Accelerated test and long-term test indicated the long-action suspension had good stability. According to pharmacokinetic test result，the AUC of Tilmicosin long-action suspension and laboratory homemade Tilmicosin solution were 43.164 9 µg·h·mL-1and 26.206 5 µg·h·mL-1，respectively. The relative bio-availability of the suspension was 164.71%. [Conclusions]The developed Tilmicosin long-action suspension was of qualified content determination，good stability and high relative bio-availability，it could be carried out mass production and applied in large-scale farms.

Tilmicosin；suspension；content；stability；pharmacokinetic；bio-availability

S859.79

B

1005-944X（2017）04-0094-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.027