非酒精性脂肪肝病病人肝细胞中趋化因子CCL4的表达水平研究

韩莹

[摘要] 目的 探讨趋化因子CCL4在非酒精脂肪性肝病（NAFLD）病人肝细胞中的表达水平，评价CCL4的表达水平是否与NAFLD的病情进展是否相关。方法 方便收集该院2013年1月—2015年11月间肝脏手术后分离培养的原代肝细胞39例，包括正常肝原代细胞13例、非酒精性脂肪肝病人肝细胞14例以及肝纤维化病人肝细胞12例，分别提取其细胞中总RNA样品并进行逆转录后，通过Real-time PCR方法分析CCL4 mRNA的表达水平。结果 CCL4的表达水平在非酒精性脂肪肝（Steatosis）病人肝细胞中的表达水平为对照组的3.64倍；而在肝纤维化（Fibrosis）病人肝细胞中的表达水平则是对照组的33.69倍，是非酒精性脂肪肝组的9.25倍，差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论 CCL4的表达水平与非酒精性脂肪性肝病的发生及进展呈正相关，可考虑用作NAFLD诊断及治疗的新靶点来进行进一步的开发研究。

[关键词] 非酒精性脂肪肝病；CCL4；表达水平

[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）12（b）-0046-03

The Expression Level of Chemokine CCL4 in the Primary Hepatocytes from NAFLD Patients

HAN Ying

Clinical Laboratory Department， The First Hospital Affiliated to Xiamen University， Xiamen， Fujian Provnce，361003 China

[Abstract] Objective To study the expression level of CCL4 mRNA in the primary hepatocytes from NAFLD patients， aiming to investigate the potential correlation between the expression level of CCL4 and the development of NAFLD. Methods We Convenient selection from January 2013 to November 2015 after liver surgery from 39 cases of primary cultured hepatocytes， including normal liver cells， 13 cases of patients with nonalcoholic fatty liver cells and liver cells in 14 cases of patients with liver fibrosis in 12 cases， the total RNA were extracted from the cells in the sample and for reverse transcription， expression analysis the level of CCL4 mRNA by Real-time PCR method. Results The expression level of CCL4 in steatosis group was 3.64 fold of that in normal group.Further， the expression level of CCL4 in fibrosis group were 33.69 fold and 9.25 fold of those in normal group and steatosis group， respectively. The differences between groups were all statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression level of CCL4 was positively correlated with the development of NAFLD， making CCL4 a potential target for NAFLD prognosis and therapy.

[Key words] NAFLD；CCL4；Expression level

非酒精性脂肪肝病 （Non-Alcoholic Fatty Liver Disease， NAFLD）与肥胖密切相关。近年来，NAFLD的发病率呈明显的上升趋势，目前已成为西方发达国家的第一大慢性肝病[1]。已经成为我国最常见的慢性肝病之一，其在人群中的发病率约为20%[2]。NAFLD可由单纯的甘油三酯蓄积所表现出来的单纯性脂肪肝（Steatosis），进一步发展成为脂肪性肝炎（Non-alcoholic Steotohepatitis， NASH），并可能最终发展为肝纤维化，肝硬化等疾病。在NAFLD病情進展中，肝脏中的炎症反应起了重要的作用。Chemokine （C-C motif） ligand 4 （CCL4）是一种趋化因子，它具有募集自由杀伤细胞及单核细胞等免疫细胞的作用[3]。它在NAFLD病情进展中的作用尚未见报道。该研究方便收集了该院2013年1月—2015年11月间进行肝胆外科手术的NAFLD不同阶段病人的肝原代细胞39例，分析其中CCL4的表达水平，以评价CCL4的表达水平是否与NAFLD病情进展具有相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

分别收取了未患NAFLD（13例）、酒精性脂肪肝（14例）、以及肝纤维化（12例）的病人肝原代细胞样本39例，包括男性患者16例，女性患者23例，平均年龄为（43.0±17.5）岁。endprint

1.2 主要實验试剂

该研究提取细胞中的总RNA过程中所使用的是Trizol试剂。RNA的逆转录及实时荧光定量Real-time PCR则分别采用RNA逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR（Real-time PCR）试剂盒进行。

1.3 研究方法

该研究采用Trizol法提取原代肝细胞中的总RNA，逆转录成cDNA后，使用Roche LC480实时定量荧光PCR仪进行分析，获取的信使RNA（mRNA）含量经由看家基因Cyclophilin进行校正后，分析mRNA的相对表达量。

1.4 统计方法

该研究采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，实验数据均以平均值±标准差（x±s）表示，采用One-way ANOVA检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

分析结果显示，在酒精性脂肪肝组（Steatosis）中，CCL4的mRNA的表达水平约为对照组（Normal）的3.64倍，P<0.05， 差异具有统计学意义；而在肝纤维化组（Fibrosis）中，CCL4的表达水平分别约为对照组的33.69倍，以及非酒精性脂肪肝组的9.25倍，P<0.05，差异具有统计学意义。见图1。

3 讨论

在肥胖人群中，由于外周脂肪组织中所释放的炎症因子通过门静脉进入肝脏，使肝脏中同样出现显著的慢性炎症反应。炎症反应是非酒精性脂肪肝病的发展过程中具有非常重要的作用，它能够促使由于脂质蓄积所引起的非酒精性脂肪肝发展为非酒精性脂肪性肝炎，继而发展为肝纤维化（Fibrosis）及肝硬化（Cirrhosis）等疾病[4-5]。趋化因子在肝脏募集免疫细胞的过程中具有重要的作用。目前，已有研究表明，趋化因子在非酒精性脂肪肝病的发展过程中同样扮演了重要的角色[6]。

目前，趋化因子CCL4与非酒精性脂肪肝病中所起的作用在国内外均未见报道。在该研究中，分析了在不同阶段非酒精性脂肪性肝病病人的原代肝细胞中CCL4的mRNA表达水平。结果显示，非酒精性脂肪肝病人（Steatosis）的肝细胞中CCL4的表达水平显著高于正常对照组，为对照组的3.64倍，提示CCL4可能与非酒精性脂肪肝的发生相关；进一步的分析显示，随着病情进展至肝纤维化（Fibrosis）阶段，病人肝细胞中CCL4的表达水平有了进一步的提高，达到了对照组的33.69倍，以及非酒精性脂肪肝组的9.25倍。这些结果反映CCL4在肝细胞中的表达水平随着非酒精性脂肪性肝病病情的进展而逐步升高，其表达水平与病情的严重程度呈正相关性，提示它可能参与了非酒精性脂肪性肝病的发生和发展过程。

尽管CCL4在非酒精性脂肪肝病中的作用尚未得到充分的研究，但CCL4在细胞中的受体CCR5则已被报道在非酒精性脂肪性肝病发展至肝纤维化的过程中具有一定的作用。CCR5的激活能够促进非酒精性脂肪肝病的进展，可引起早期肝纤维化[7]；而拮抗CCR5的活性则能够显著抑制小鼠的肝纤维化[8]。由于CCR5介导了CCL4在细胞中的作用通路，结合结果，有理由相信，CCL4可能在非酒精性脂肪性肝病发展的过程中具有一定的作用，可考虑作为非酒精性脂肪性肝病的治疗靶点，进行更深入的开发研究。

[参考文献]

[1] Bazick J， Donithan M， Neuschwander-Tetri BA， et al. Clinical Model for NASH and Advanced Fibrosis in Adult Patients With Diabetes and NAFLD： Guidelines for Referral in NAFLD [J]. Diabetes Care，2015，38（7）：1347-1355.

[2] Li Z， Xue J， Chen P， et al. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease in mainland of China： a meta-analysis of published studies[J].J Gastroenterol Hepatol，2014，29（1）：42-51.

[3] Bertino G， Demma S， Ardiri A， et al. The immune system in hepatocellular carcinoma and potential new immunotherapeutic strategies [J]. Biomed Res Int，2015：731469.

[4] Carr RM， Oranu A， Khungar V. Nonalcoholic Fatty Liver Disease： Pathophysiology and Management. Gastroenterol Clin North Am [J]. 2016 ，45（4）：639-652.

[5] Magee N， Zou A， Zhang Y. Pathogenesis of Nonalcoholic Steatohepatitis： Interactions between Liver Parenchymal and Nonparenchymal Cells[J].Biomed Res Int，2016：5170 402.

[6] Xu L， Kitade H， Ni Y， et al. Roles of Chemokines and Chemokine Receptors in Obesity-Associated Insulin Resistance and Nonalcoholic Fatty Liver Disease [J]. Biomol ecules，2015，5（3）：1563-1579.

[7] Li BH， He FP， Yang X， et al. Steatosis induced CCL5 contributes to early-stage liver fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease progress [J]. Transl Res，2016.

[8] Lefebvre E， Moyle G， Reshef R， et al. Antifibrotic Effects of the Dual CCR2/CCR5 Antagonist Cenicriviroc in Animal Models of Liver and Kidney Fibrosis [J]. PLoS One，2016，11（6）：e0158156.

（收稿日期：2016-09-15）endprint