大豆异黄酮脂质体的包封率测定及其物理性质检测

2017-05-31何欢陈惠杰刁磊

吉林农业·下半月 2017年5期

何欢+陈惠杰+刁磊

摘要：目的：对制备的大豆异黄酮脂质体进行包封率测定，并对其物理性质进行检测。方法：采用透析法测定大豆异黄酮脂质体的包封率，并对脂质体的形态、pH值和稳定性进行观察检测。结果表明：大豆异黄酮脂质体的包封率41.25%±0.30%，形态圆整，pH值为6.18，稳定性良好。结论：大豆异黄酮脂质体的包封率测定方法可行，脂质体的基本物理性质良好。

关键词：大豆异黄酮；脂质体；包封率

基金项目：吉林农业科技学院青年基金项目（项目编号：吉农院合字[2015]第231号）；吉林农业科技学院省级大学生科技創新科研项目（项目编号：吉农院合字[2015]第013号）

中图分类号： R927 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.10.021

大豆异黄酮（soybean isoflavone）是从豆科植物大豆中提取的一类化学物质，属于黄酮类化合物中的异黄酮类成分，具有苦涩味和收敛性[1]。大豆异黄酮在常温下性质稳定，可溶于醇类、酯类和酮类，难溶于石油醚、正己烷等[2]。大豆异黄酮与雌激素结构类似，可与雌激素受体α、β结合，具有类雌激素活性和抗雌激素活性，可降低骨质疏松发生，预防乳腺癌，预防心血管疾病，改善妇女绝经期综合症的作用[3]。

脂质体（liposome）是采用磷脂及胆固醇等原料，通过适宜的制备方法形成一种类似生物膜结构的包裹药物的双分子小囊[4]。脂质体结构能够降低药物的消除速率，延长药物作用时间，增加药物的体内外稳定性，而且药物被包封于脂质体内，能够降低药物毒性，增强药理作用[5]。鉴于此，本实验选用脂质体作为大豆异黄酮的载体，将其制备成脂质体，从而发挥药物的最佳治疗作用。

1 材料

1.1药品与主要试剂

大豆苷元标准品，纯度98%（美国Sigma公司）。大豆异黄酮（含量为80%，大连绿峰食品有限公司）。高纯度大豆磷脂（德国德固赛公司）。胆固醇（上海东尚实业有限公司）。乙醇（分析纯）。

1.2主要仪器

SP-756P紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。Scientz-ⅡD型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。Sartorius BT25S电子天平（德国Sartorius公司）。HJ-6A型数显恒温多头磁力搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。TECNAIG2型透射电子显微镜（荷兰飞利浦公司）。

2 方法

2.1 大豆异黄酮脂质体的制备

称取处方量的大豆磷脂、胆固醇和大豆异黄酮，置于烧杯中，加入乙醚溶液15.0毫升，搅拌使其溶解，最后加入pH值为7.4的PBS缓冲液3.0毫升，形成两相系统。将烧杯放入超声波细胞粉碎机内冰浴超声7分钟，倒入茄型瓶中，置于旋转蒸发仪上，在水浴25℃环境下，减压旋转蒸发除去乙醚，再加入pH值为7.4的PBS缓冲液10.0毫升，置于旋转蒸发仪上旋转2小时，以分散脂质体，制得溶液用0.22μm微孔滤膜过滤即可。

2.2 脂质体粒子形态观察

用pH值为7.4的PBS缓冲液将大豆异黄酮脂质体稀释50倍，然后滴加到有支持膜的铜网上，再用2%磷钨酸进行染色，晾干，用透射电子显微镜观察粒子形态。

2.3 脂质体pH值的测定

大豆磷脂为不饱和磷脂，易氧化水解，其氧化水解速率受pH值的影响较大，文献报道磷脂成分均在pH值为6.5时最稳定，用pH值测定仪测定大豆异黄酮脂质体的pH值，评价其稳定性。

2.4 包封率的测定

2.4.1 标准品溶液的配制取大豆苷元标准品6.0毫克，置于50毫升容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容至刻度，得到浓度为120μg·mL-1标准品储备液，备用。

2.4.2 标准曲线的制备用移液管量取标准品储备液0.5毫升、1.0毫升、1.5毫升、2.0毫升、2.5毫升、3.0毫升，分别置于10毫升容量瓶中，用50%乙醇稀释并定容，得到浓度分别为6μg·mL-1、12μg·mL-1、18μg·mL-1、24μg·mL-1、30μg·mL-1、36μg·mL-1的溶液。用紫外分光光度计在260 nm波长下[6]分别测其吸光度，以浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。

2.4.3 加样回收率的测定取大豆异黄酮样品4.0毫克，置于100毫升容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容至刻度。取1.0毫升该溶液置于10毫升容量瓶中，分别加标准品储备液0.5毫升、1.0毫升、2.0毫升混匀后定容至刻度，在260nm下测定吸光度，计算加样回收率。

2.4.4 重复性实验取大豆异黄酮样品4.0毫克，置于100毫升容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容至刻度。在260nm下测定吸光度，重复测定6次，计算RSD。

2.4.5 脂质体包封率测定将大豆异黄酮脂质体1.0毫升置于已处理过的透析袋中，封口，将其置于100毫升 pH值为7.4的PBS缓冲液中，室温下磁力搅拌透析4.5小时，透析结束后，将透析袋内样品全部取出，转移至50毫升容量瓶中，加入1.0毫升 10% Triton X-100乙醇溶液，充分震荡，然后再加入50%乙醇定容至刻度，用紫外分光光度计测其吸光度，计算被包裹的大豆异黄酮含量。另取1.0毫升大豆异黄酮脂质体，置于50毫升容量瓶中，加入1.0毫升10% Triton X-100乙醇溶液，充分震荡，然后再加入50%乙醇定容至刻度，用紫外分光光度计测其吸光度，测定大豆异黄酮的投药量。按计算大豆异黄酮的包封率。

计算公式：包封率%=被包裹大豆异黄酮含量/大豆异黄酮总投药量×100%

2.5 稳定性的测定

取大豆异黄酮脂质体3批样品，分别于4℃和25℃条件下保存30天，以包封率为主要指标，同时观察外观状态变化，考察大豆异黄酮脂质体的稳定性。

3 结果

3.1 大豆异黄酮脂质体的外观形态

制备的大豆异黄酮脂质体为乳白色的澄清液体，无沉淀及粒子存在，图1为大豆异黄酮脂质体的外观。

3.2 大豆异黄酮脂质体的粒子形态

用透射电子显微镜观察制备的脂质体，粒子为类球形，分布较为均匀，图2为脂质体显微照片。

3.3大豆异黄酮脂质体的pH值测定

测得大豆异黄酮脂质体的pH值为6.18，基本符合要求。

3.4 大豆异黄酮脂质体的包封率测定结果

3.4.1标准曲线的绘制标准曲线见图3，经计算得线性回归方程A=0.0878C+0.2985，R2=0.9994表明大豆异黄酮在6～36μg·mL-1范围内与吸光度具有良好的线性关系。