高效液相色谱法同时测定改善睡眠颗粒中天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素含量的应用

张美玲+陈彦杰+赵亭+褚银铃+张洁+房艳+贾德贤

[摘要]目的 建立高效液相色谱同时测定“改善睡眠颗粒”中天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素含量的方法。方法 检测对象为以上提到的“改善睡眠颗粒”中的四个主要成分。采用的色谱柱为Thermo Fisher Syncronis C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；柱温为30℃，进样量为10 μl。检测波长分别设定为220、238、275、335 nm。结果 天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素分别在0.8032～4.0160、0.5392～2.6960、2.6916～13.4580、0.2112～1.0560 μg范围内线性关系良好；精密度、稳定性、重复性试验的均RSD<2.00%；加样回收率分别为98.17%、99.37%、98.84%、99.27%；RSD分别为0.67%、0.48%、0.49%、0.93%。结论 高效液相色谱法可同时测定“改善睡眠颗粒”中天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素的含量，且该方法简便、准确，可用于该制剂的质量控制。

[关键词]改善睡眠颗粒；高效液相色谱；天麻素；红景天苷；栀子苷；斯皮诺素

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）12（b）-0011-04

The application of simultaneous determination of Gastordine，Salidroside，Geniposide and Spinosin in “Gaishanshuimian Granules” by HPLC

ZHANG Mei-ling CHEN Yan-jie ZHAO Ting CHU Yin-ling ZHANG Jie FANG Yan JIA De-xian

Ovation Health Science and Technology Co.Ltd.，ENN Group，Langfang 065001，China

[Abstract]Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of four constituents （Gastordine，Salidroside，Geniposide，Spinosin） in “Gaishanshuimian Granules”.Methods Aforementioned four major constituents in “Gaishanshuimian Granules” as the detecting subject.Column was Thermo Fisher Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）.Mobile phase was acetonitrile-water，gradient elute，flow rate was 1.0 ml/min.Column temperature was maintained at 30℃，sample size was 10 μl.Detection wavelengths were set at 220，238，275 and 335 nm.Results Linear range of Gastordine，Salidroside，Geniposide，and Spinosin respectively were 0.8032-4.0160，0.5392-2.6960，2.6916-13.4580，0.2112-1.0560 μg.The RSD of precision，stability and repeatability test were all less than 2.00%.The average recoveries respectively were 98.17%，99.37%，98.84% and 99.27% with RSD of 0.67%，0.48%，0.49% and 0.93%，respectively.Conclusion This developed HPLC method is reliable and convenient for simultaneous determination of Gastordine，Salidroside，Geniposide，and Spinosin，which could be applied to determine contents of four constituents and quality control of "Gaishanshuimian Granules".

[Key words]Gaishanshuimian Granules；HPLC；Gastordine；Salidroside；Geniposide；Spinosin

睡眠對人是必不可少的休息方式，通过睡眠使疲劳的神经细胞恢复正常的生理功能，精神和体力得到恢复。然而，随着社会的快速发展及生存环境的变化，具有睡眠方面障碍的人数量越来越多。睡眠障碍严重影响着人们的身心健康、生活质量和工作效率。“改善睡眠颗粒”由天麻、酸枣仁、红景天及栀子等中药组成，是新绎健康科技有限公司依据临床经验方加减，开发为具有改善睡眠作用的保健食品。方中天麻为君药，酸枣仁为臣药，天麻具有镇静催眠、镇痛、益智等作用[1]，天麻素是天麻的主要成分，具有多种药理作用，包括神经衰弱综合症、阿尔茨海默病综合症、帕金森病等[2-4]。酸枣仁具有镇静催眠、镇痛、抗血小板聚集等作用[5-6]。斯皮诺素为黄酮碳苷类成分，是酸枣仁主要成分之一，现代药理研究表明能显著增强戊巴比妥诱导的睡眠，表现在睡眠时间增加和睡眠潜伏期减少，其作用机制可能与拮抗5-HT（1A）受体有关[7-8]。藏药红景天是我国珍贵的药材，享有“高原人参”的美誉，红景天除用于治疗高原反应，近年研究表明具有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、治疗心血管疾病及神经系统疾病等[9]，主要成分红景天苷是研究的热点，已报道的药理作用有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基、增强记忆、改善睡眠等[10-11]。栀子为药食两用的物品，不仅在中医临床中经常使用，在食品与保健食品中也应用广泛，现代药理研究表明，栀子具有保肝利胆、降压、镇痛、镇静等作用[12]，其主要活性成分是栀子苷和栀子黄色素，栀子苷也呈现多种药理作用[13]。基于以上分析，本实验采用HPLC方法同时测定“改善睡眠颗粒”中天麻素、红景天苷、栀子苷及斯皮诺素四个主要成分的含量，可以较好的反应该制剂的作用物质基础，为其质量控制研究提供参考。

1材料

1.1仪器和设备

Thermo Ultimate 3000双三元高效液相色谱仪[（DGLC），美国赛默飞世尔公司]；十万分之一分析天平（瑞士 Mettler-Toledo公司）；KQ250DB型超声波清洗仪（昆山市超声波仪器有限责任公司）。

1.2药品与试剂

“改善睡眠颗粒”及其提取物中间体均为新奥集团新绎健康科技有限公司提供。天麻素、红景天苷、栀子苷、斯皮诺素对照品均购自于北京欣荣科技有限公司（批号分别为150708、150619、150612、150807）。乙腈为色谱纯，水为高纯水；除另有规定外，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Thermo Fisher Syncronis C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈（A）-水（B）为流动相，洗脱梯度为0～3 min，6%A；3～13 min，6%～18%A；13～22 min，18%～40%A；22～23 min，40%～6%A；23～30 min，6%A。流速1.0 ml/min，柱温25℃，进样量10 μl。按上述色谱条件，各成分分离度良好，测定结果见图1和图2。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液制备 精密称取对照品适量，置入10 ml量瓶中，用甲醇溶解定容，配制浓度分别为天麻素200.8 μg/ml、红景天苷134.8 μg/ml、栀子苷672.9 μg/ml、斯皮诺素52.8 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取“改善睡眠颗粒”提取物中间体及小试颗粒各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25 ml，称定重量，超声处理（功率100 W，频率45 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液4、8、12、16、20 μl注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积。以进样量（μg）为横坐标（x），峰面积值为纵坐标（y）进行线性回归，得各成分的回归方程（表1）。

2.4精密度试验

取“2.1”项下制备的混合对照品溶液，连续测定6次，记录各成分峰面积。结果，天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素峰面积的RSD分别为0.50%、0.23%、0.20%和0.23%，表明仪器的精密度良好。

2.5稳定性试验

精密吸取“2.2”项下制备的样品溶液各20 μl，分别在配置后0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录各成分峰面积。结果表明天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素峰面积的RSD分别为1.94%、0.59%、0.75%和1.64%，表明对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取同一批小試颗粒样品6份，按“2.2”项下方法操作制备供试品溶液，进样测定，记录各成分峰面积，结果表明天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素峰面积的RSD分别为0.70%、0.45%、0.67%和1.48%，表明该方法重复性良好。

2.7加样回收率试验

精密称取同法测定的已知含量小试颗粒样品共6份，分别精密加入混合对照品适量，按“2.2”项下的方法制备样品溶液，记录各成分峰面积，经计算结果如表2，回收率在98.0%～99.5%，表明本法准确度较好。

2.8样品含量的测定

取一批小试颗粒和四种提取工艺下的提取物中间体。按“2.2.2”项下进行溶液制备，平行制备3份。按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积并计算含量，结果见表3。

本实验确定的方法同时测定样品（四种工艺下制备的复方提取物及小试颗粒样本）中天麻素、红景天苷、栀子苷及斯皮诺素的含量进行了测定，四种成分都能检出，并且能够完全分离，说明此法可以指导提取工艺的优化及样品的质量控制。

3讨论

3.1提取溶剂的选择

供试品制备过程中，根据指标性成分的性质，选择甲醇、60%甲醇、30%甲醇和水为提取溶剂，超声提取40 min，发现甲醇浓度越高不溶物越多。水为溶剂时提取溶液较澄清，各成分能达到有效分离，且各成分的提取率最高，故最终选择水作为提取溶剂。

3.2 检测波长的选择

根据《中国药典》2015年版天麻、栀子、红景天和酸枣仁项下的规定，天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素的最大吸收波长分别为220、238、275、335 nm[14]，因此，分别在以上波长下积分计算峰面积，保证结果的准确性。

3.3 流动相的选择

天麻素、栀子苷、红景天苷和斯皮诺素在《中国药典》2015年版中各成分测定的色谱条件中流动相除红景天苷使用甲醇-水外，其余都是乙腈-水；水相只有测定天麻素时是0.05%磷酸水溶液，同时也参考了文献报道的液相条件[15-18]，确定本实验中同时测定这四种成分含量的流动相为乙腈-水。经过摸索确定适合的洗脱程序，各成分峰型良好，且分离度均>1.5。本文确定的同时测定“改善睡眠颗粒”中天麻素、红景天苷、栀子苷及斯皮诺素含量的HPLC方法，样品制备方法简单，分离效果良好，专属性强、精密度高、重复性较好，为提取工艺的确定提供依据，为“改善睡眠颗粒”质量标准的制定提供参考。

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