牛角瓜根的抑菌活性研究

杨军辉 何翠华 高非 王祝年

摘 要 以牛角瓜根为实验材料，采用索氏提取法，以4种不同溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇）对牛角瓜的根进行提取，并采用纸片琼脂扩散法对粗提物的抑菌活性进行了评价，供试菌包括白色念珠菌等6种真菌和金黄色葡萄球菌等7种细菌。结果表明：石油醚粗提物对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、大肠埃希氏菌都表现出良好的抑菌活性，且抑菌效果接近或优于阳性对照氟康唑，对尖孢镰刀菌和鲍曼不动杆菌也表现出良好的抑菌活性；氯仿粗提物对白色念珠菌及粪链球菌表现出良好的抑菌活性；乙酸乙酯粗提物对粪链球菌表现出最好的抑菌活性；甲醇粗提物的抑菌活性较弱。

关键词 牛角瓜；根粗提物；纸片琼脂扩散法；抑菌活性；氟康唑

中图分类号 S567.19 文献标识码 A

Antifungal and Antimicrobial Activity of Root Extracts

from Calotropis gigantea

YANG Junhui1， HE Cuihua2， GAO Fei1 *， WANG Zhunian1

1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of

Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan

571737， China

2 Technical Center of Inspection & Quarantine Bureau， Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，

Haikou， Hainan 570100， China

Abstract This research was to evaluate the antimicrobial activities of the root extracts of Calotropis gigantea. The root of C. gigantean was extracted by the Soxhlet extraction method with four different solvents， including petroleum ether， chloroform， ethyl acetate and methyl alcohol. The antimicrobial activities were evaluated against 6 tested fungi and 7 tested bacteria using disc agar diffusion method. The antimicrobial results showed that the petroleum ether root extracts exhibited excellent antimicrobial activities against Bacillus subtilis（ATCC11774）， Candida albicans（ATCC10231）， Aspergillus niger（ATCC16404）and Escherichia coil（ATCC25922）. And the antimicrobial activities were equal to or even better than the positive control fluconazole. The petroleum ether root extracts also showed good antimicrobial activities against Fusarium oxyporum（ATCC41029）and Acinetobacter baumanii （ATCC19606）； the chloroform root extracts displayed good antifungal activity against C. albicans（ATCC10231）and Streptococcus faecalis（ATCC29212）； the ethyl acetate root extracts exhibited excellent antibacterial activity against S. faecalis（ATCC29212）； the methyl alcohol root extracts showed weak antimicrobial activities.

Key words Calotropis gigantean； root extracts； disc agar diffusion； antimicrobial activities； fluconazole

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.028

牛角瓜（Calotropis gigantea），又稱羊浸树、断肠草、五狗卧花心等，属萝藦科（Asclepiadaceae）牛角瓜属植物[1-2]，主要分布在中国海南、广东、四川和云南等地[2]，是近年发现的有较高利用潜力的能源植物之一[3-4]。牛角瓜具有广泛的药用价值[5-7]，研究还发现，牛角瓜具有显著的抗肿瘤作用[8-13]，且其中所含的一些强心苷和甾类物质具有抑菌、杀虫等作用[14-19]。有学者对牛角瓜的不同部位脂溶性提取物作了抑菌活性研究[20]，结果显示脂溶性提取物对大肠埃希氏菌、普通变形杆菌和枯草芽孢杆菌都有一定的抑制作用。本研究组[21]研究结果表明，牛角瓜花的脂溶性成分对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。近年来，国内对于牛角瓜抑菌方面的研究相对较少，本文根据牛角瓜根脂溶性成分的GC-MS分析[22]，对牛角瓜根采用不同极性溶剂进行提取，并选取多种供试菌，对得到的不同溶剂的粗提物进行抑菌活性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 牛角瓜根于2015年7月采自海南省儋州市三都镇，经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所王祝年研究员鉴定为萝藦科牛角瓜属植物牛角瓜（Calotropis gigantea （L.） Dry.ex Ait.f.）的根，存放于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所。

1.1.2 供试菌种及培养基 试验菌种及培养基由海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心微生物实验室提供。

真菌：白色念珠菌Candida albicans（ATCC10231），串珠镰刀菌Fusarium moniliforme（ATCC2490），黄曲霉菌Aspergillus flavus（ATCC2003），尖孢镰刀菌Fusarium oxyporum（ATCC41029），黑曲霉菌Aspergillus niger（ATCC16404），变紫青霉Penicillium purpurascens（ATCC40687）。

细菌：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus （ATCC25923），枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis （ATCC11774），鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumanii（ATCC19606），大肠埃希氏菌Escherichia coil（ATCC25922），粪链球菌Streptococcus faecalis（ATCC29212），肺炎克雷伯菌Klebsiella Pneumoniae（ATCC200603），铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa（ATCC27853）。

1.1.3 试剂 石油醚，氯仿，乙酸乙酯，甲醇，丙酮，均购于广州化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 牛角瓜根粗提物的制备 将采集的新鲜牛角瓜根晒干后粉碎，用密封袋密封保存备用。定量称取粉碎后的牛角瓜根粉末，用索氏提取器依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和甲醇4种溶剂进行提取。所得提取液经旋转蒸发浓缩得浸膏，置于冰箱中保存备用。

1.2.2 菌种培养 配置各菌种并经传代1次纯培养后，用接种环挑取单个细菌菌落接种于脑心浸液琼脂培养基中划线涂布三区[23-24]，同法接种真菌于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，于恒温培养箱37 ℃培养24 h（其中尖孢镰刀菌和变紫青霉于恒温培养箱30 ℃培养）。

1.2.3 MH（Mueller-Hinton）琼脂培养基制备 称取15.2 g基础培养基MH琼脂于500 mL的三角瓶中，加400 mL去离子水定容后，121 ℃高压灭菌15 min。待基础培养基的温度冷却至45 ℃左右时在无菌条件下倾注平板，凝固后待用。

1.2.4 样液的配置 空白组：10%的丙酮溶液。

实验组：用10%的丙酮溶液将牛角瓜根的不同溶剂的提取浸膏配制成100 mg/mL的供试样液。

阳性对照组：用10%的丙酮溶液将氟康唑配制成100 mg/mL的对照样液。

1.2.5 抑菌活性测定方法 抑菌圈的测定：采用纸片琼脂扩散法[25-26]进行抑菌圈测定，用无菌棉拭子涂拭少许24 h菌种培养物于生理盐水并稀释为105 CFU/mL的试验菌液，用另一只无菌棉拭子将菌液均匀涂布于MH琼脂平板表面，待稍干后用无菌镊子夹取经样液浸泡完全的圆滤纸片（直径6.00 mm），贴于MH琼脂平板表面。37 ℃恒温培养箱培养24 h后观察并测量抑菌圈直径。不同溶剂的供试样液抑菌实验重复3次，最后抑菌结果取3次的平均值。

最低抑制浓度（MIC）的测定：将100 mg/mL供试样液用10%丙酮分别进行连续二倍稀释，得浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg/mL的样液待测。根据抑菌实验结果，取对供试菌抑制效果明显的供试样液，继续以上述测抑菌圈的实验方法测定最低抑制浓度（MIC）。以无抑菌圈（即滤纸片周围供试菌生长良好）的最高浓度为该样液的最低抑制浓度。

2 结果与分析

2.1 牛角瓜根的石油醚粗提物对供试菌的抑制作用

根的石油醚粗提物的抑菌活性见表1。从表1可看出，空白实验组对供试菌无抑制作用，表明10%丙酮溶剂对抑菌活性无影响。在100 mg/mL浓度下，牛角瓜根的石油醚粗提物对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希氏菌、尖孢镰刀菌、鲍曼不动杆菌表现出良好到优秀的抑菌效果，其中对枯草芽孢杆菌表现出最优的抑菌活性，且抑菌活性优于阳性对照氟康唑，抑菌圈为13.83 mm；对白色念珠菌（抑菌圈为13.37 mm）表现出接近于氟康唑（抑菌圈为14.37 mm）的抑菌活性；對黑曲霉、大肠埃希氏菌、尖孢镰刀菌、鲍曼不动杆菌也表现出优于阳性对照氟康唑的抑菌活性。另外，在100 mg/mL浓度下，石油醚粗提物对粪链球菌、黄曲霉、金黄色葡萄球菌、变紫青霉均有抑制作用，除对黄曲霉表现出接近于氟康唑的抑菌效果外，对其他供试菌的抑制效果都明显弱于氟康唑。同时，石油醚粗提物对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和串珠镰刀菌均没有表现出抑制活性。

根不同浓度的石油醚粗提物的抑菌活性见表2。从表2可看出，随着牛角瓜根粗提物浓度的二倍稀释，抑菌作用也随之减小，抑菌效果与粗提物浓度呈正相关。牛角瓜根的石油醚粗提物对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希氏菌的最低抑制浓度分别为6.25、1.56、3.125、1.56 mg/mL。

2.2 牛角瓜根的氯仿粗提物对供试菌的抑制作用

根的氯仿粗提物的抑菌活性见表3。从表3可看出，在100 mg/mL浓度下，氯仿粗提物对白色念珠菌和粪链球菌表现出相同的抑菌效果（10.59 mm）。与阳性对照氟康唑相比，氯仿粗提物对白色念珠菌的抑菌活性明显弱于氟康唑（14.37 mm），对粪链球菌的抑菌活性则优于氟康唑（10.22 mm）。氯仿粗提物对尖孢镰刀菌、黄曲霉、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉均有一定的抑菌活性，其中对尖孢镰刀菌和黄曲霉表现出优于氟康唑的抑菌活性，对其余供试菌的抑菌活性低于氟康唑。氯仿粗提物对枯草芽孢杆菌、变紫青霉、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和串珠镰刀菌均没有表现出抑菌效果。

从表4则可以看出，牛角瓜根的氯仿粗提物对白色念珠菌和粪链球菌的最低抑制浓度分别为3.125 mg/mL和1.56 mg/mL。

2.3 牛角瓜根的乙酸乙酯粗提物对供试菌的抑制作用

根的乙酸乙酯粗提物的抑菌活性见表5。从表5可看出，乙酸乙酯粗提物对粪链球菌（抑菌圈为12.66 mm）表现出优秀的抑菌效果，且抑菌效果明显优于氟康唑（抑菌圈为10.22 mm）。对白色念珠菌，乙酸乙酯粗提物也表现了良好的抑菌活性（抑菌圈为10.48 mm），但抑菌活性与氟康唑（抑菌圈为14.37 mm）存在较大的差距。对尖孢镰刀菌，乙酸乙酯粗提物也表现出优于氟康唑的抑菌活性，但对枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、变紫青霉、黄曲霉、黑曲霉、金黄色葡萄球菌，乙酸乙酯粗提物的抑菌活性均低于氟康唑。对铜绿假单胞菌、串珠镰刀菌、肺炎克雷伯菌，乙酸乙酯粗提物沒有表现出抑菌活性。

从表6则可以看出，牛角瓜根的乙酸乙酯粗提物对粪链球菌的最低抑制浓度为3.125 mg/mL。

2.4 牛角瓜根的甲醇粗提物对供试菌的抑制作用

根的甲醇粗提物的抑菌活性见表7。从表7可以看出，甲醇粗提物对黑曲霉、粪链球菌、黄曲霉、大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、变紫青霉都有一定的抑菌活性，除了对黑曲霉（抑菌圈为10.34 mm）表现出优于氟康唑（抑菌圈为9.94 mm）的抑菌活性外，对其余供试菌的抑菌活性均比氟康唑弱。同时，甲醇粗提物对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、尖孢镰刀菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、串珠镰刀菌均没有抑菌活性。

3 讨论

牛角瓜资源丰富，具有广泛的药用价值，用于治疗各种疾病，在抗菌和抗肿瘤方面引起了广泛关注。Ishnava等[18]对白花牛角瓜乳汁进行了体外抑菌活性研究，结果表明氯仿提取物对嗜酸乳酸杆菌和变异链球菌有明显的抑菌效果，甲醇提取物对缓症链球菌具较好的抑菌活性。Sehgal等[27]报道了白花牛角瓜在体外杀虫、驱虫等的作用。Kareem等[28]报道了白花牛角瓜对致病性细菌和真菌的抗菌活性。Parhira[11]等从牛角瓜乳汁中分离出的2种强心苷，对低氧诱导因子（HIF-1α）具有一定的抑制作用。

本研究采用索氏提取法，以牛角瓜根为材料，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇4种溶剂依次提取，对粗提物进行了更广泛的供试菌的抑菌活性研究。结果表明，4种不同溶剂粗提物的抑菌效果存在很大差异，对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希氏菌，石油醚粗提物均表现出优秀的抑菌活性，且抑菌效果接近或优于阳性对照氟康唑，对尖孢镰刀菌和鲍曼不动杆菌也表现出良好的抑菌活性；氯仿粗提物对白色念珠菌及粪链球菌表现出良好的抑菌活性；乙酸乙酯粗提物对粪链球菌表现出最好的抑菌活性；甲醇粗提物的抑菌效果较弱，且对多种菌没有活性。4种溶剂粗提物对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希氏菌、尖孢镰刀菌和鲍曼不动杆菌的抑制能力均为：石油醚粗提物优于乙酸乙酯、氯仿和甲醇粗提物；对粪链球菌的抑制能力为：乙酸乙酯粗提物最优。可见，除粪链球菌外，石油醚粗提物表现出最广谱及最优的抑菌活性。由结果分析，造成不同溶剂粗提物抑菌活性差异的原因可能有：①溶剂使用的先后顺序。由于石油醚最先使用，因此大部分活性物质优先溶解于石油醚中，其次是氯仿与乙酸乙酯，最后是甲醇，这就使得石油醚粗提物具有最优的抑菌效果；②溶剂的极性。乙酸乙酯粗提物对粪链球菌表现出最好的抑菌效果，但乙酸乙酯在第三位被使用，根据“相似相溶”原理推测，对粪链球菌高效的抑菌活性物质在极性相对较低的溶剂中溶解较少，在和它极性相似的乙酸乙酯中溶解较多，推测溶剂的极性对抑菌物质的提取有较大的影响；③抑菌活性物质的种类。不同溶剂粗提物的抑菌效果存在很大差异，推测各种粗提物的组分各不相同。由于不同的溶剂粗提物是混合组分，在抑菌过程中可能存在协同、拮抗等机制，为今后的单体抑菌活性研究奠定了基础。

参考文献

[1] 中国科学院华南植物研究所. 海南植物志（第3卷）[M]. 北京： 科学出版社， 1974： 255.

[2] 中国科学院植物志编辑委员会. 中国植物志（第63卷）[M]. 北京： 科学出版社， 1977： 384-386.

[3] 傅登祺， 黄宏文， 武 汉. 能源植物资源及其开发利用简况[J]. 植物科学学报， 2006， 24（2）： 183-190.

[4] 李 瑞， 曾建立， 王晓东， 等. 耐盐碱植物牛角瓜产能成分分析[J]. 过程工程学报， 2007， 7（6）： 1 217-1 220.

[5] 杜海燕. 白花牛角瓜根氯仿提取物抗胃溃疡作用的实验研究[J]. 国际中医中药杂志， 1998（3）： 40.

[6] 张士俊. 白花牛角瓜根提取物的抗炎镇痛作用[J]. 现代药物与临床， 1991（6）： 270-271.

[7] 李琬聪， 晏永明， 钟惠民. 白花牛角瓜根部的化学成分研究[J]. 天然产物研究与开发， 2012， 24（10）： 1 390-1 392.

[8] Mijatovic T， Van Q E， Delest B， et al. Cardiotonic steroids on the road to anti-cancer therapy[J]. Biochimica Et Biophysica Acta， 2007， 1776（1）： 32-57.

[9] Mijatovic T， Kiss R. Cardiotonic Steroids-Mediated Na+/K+-ATPase Targeting Could Circumvent Various Chemoresistance Pathways[J]. Planta Medica， 2013， 79（3-4）： 189-198.

[10] You H， Lei M， Song W， et al. Cytotoxic cardenolides from the root bark of Calotropis gigantea[J]. Steroids， 2013， 10（10）： 1 029-1 034.

[11] Parhira S， Zhu G Y， Jiang R W， et al. 2'-Epi-uscharin from the latex of Calotropis gigantea with HIF-1 inhibitory activity[J]. Scientific Reports， 2014， 4： 4 748-4 748.

[12] Calderón-Montano J M， Burgos-Morón E， Orta M L， et al. Evaluating the cancer therapeutic potential of cardiac glycosides[J]. Biomed Research International， 2014， 1： 85-117.

[13] Ibrahim S R M， Mohamed G A， Shaala L A， et al. Calotroposides H-N， new cytotoxic oxypregnane oligoglycosides from the root bark of Calotropis procera[J]. Steroids， 2015， 96： 63-72.

[14] Larhsini M， Oumoulid L， Lazrek H B， et al. Antibacterial activity of some Moroccan medicinal plants[J]. Phytotherapy Research， 2001， 15（3）： 250-252.

[15] Ali N A A， Jülich W D， Kusnick C， et al. Screening of Yemeni medicinal plants for antibacterial and cytotoxic activities[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2001， 74（2）： 173-179.

[16] Ahmed U A M， Shi Z， Bashier N H H， et al. Evaluation of Insecticidal Potentialities of Aqueous Extracts from Calotropis procera Ait. Against Henosepilachna elaterii Rossi[J]. Journal of Applied Sciences， 2006， 6（11）： 2 466-2 470.

[17] Lima-Filho J V， Patriota J M， Silva A F B， et al. Proteins from latex of Calotropis procera prevent septic shock due to lethal infection by Salmonella enterica serovar Typhimurium[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2010， 129（3）： 327-334.

[18] Ishnava K B， Chauhan J B， Garg A A， et al. Antibacterial and phytochemical studies on Calotropis gigantia （L.） R. Br. latex against selected cariogenic bacteria[J]. Saudi Journal of Biological Sciences， 2012， 19（1）： 87-91.

[19] Rajkuberan C， Sudha K， Sathishkumar G， et al. Antibacterial and cytotoxic potential of silver nanoparticles synthesized using latex of Calotropis gigantea L[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy， 2015， 136： 924-930.

[20] 鄧 佳， 王 芳， 史正军， 等. 野生牛角瓜不同部位脂溶性提取物抑菌活的性研究[J]. 北方园艺， 2014（24）： 144-146.

[21] 王茂媛， 王建荣， 张新蕊， 等. 牛角瓜花脂溶性成分及其抗菌活性研究[J]. 中药材， 2013， 36（3）： 404-407.

[22] 王茂媛， 戴好富， 王祝年. 牛角瓜根脂溶性成分的GC-MS分析[J]. 热带作物学报， 2010， 31（11）： 2 039-2 042.

[23] 田树革， 刘 庆. 新疆芍药色谱图谱分析及芍药苷的含量测定[J]. 中国民族医药杂志， 2003（4）： 32-33.

[24] 李明远. 微生物学与免疫学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2002： 84-126.

[25] Bauer A W， Perry D M， Kirby W M. Single-disk antibiotic-sensitivity testing of staphylococci： an analysis of technique and results[J]. A M A archives of Internal Medicine， 1959， 104（104）： 208-216.

[26] Bauer A W， Kirby W M， Sherris J C， et al. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method[J]. American Journal of Clinical Pathology， 1966， 45（3）： 493-496.

[27] Sehgal R， Arya S， Kumar V L， et al. Inhibitory effect of extracts of latex of Calotropis procera against Candida albicans： A preliminary study[J]. Indian Journal of Pharmacology， 2005， 37（5）： 334-335.

[28] Parekh J， Chanda S V. In vitro Antimicrobial activity and phytochemical analysis of some Indian medicinal plants[J]. Turkish Journal of Biology， 2007， 31（1）： 53-58.