家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

梁湘　李俊　陈慧珠　卓秋红　龙羽燕　屈达才

摘要：【目的】建立针对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的环介导等温扩增（LAMP）可视化检测技术，为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持。【方法】以BmNPV多角体蛋白基因polh为扩增靶标，分别设计5组内/外引物和5条环引物，根据扩增效率筛选最佳引物组合；优化LAMP反应条件，并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验；使用羟基萘酚蓝（HNB）染色对结果进行比色观察，对简化样品处理的条件进行摸索。【结果】使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7 fg/μL，检测灵敏度得到有效提高，且反应时间缩短。建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性，对样本的检出率高于常规PCR，其最低检测限是常规PCR的100倍。在反应前加入HNB，结果易判断且能减少交叉污染。感染家蚕血淋巴进行100 ℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应，既简化了操作步骤，又降低了检测成本。【结论】针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点，适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断。

关键词： 家蚕核型多角体病毒（BmNPV）；家蚕血液型脓病；LAMP；早期诊断；可视化

中图分类号： S884.51 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0163-06

Abstract：【Objective】The present study established loop-mediated isothermal amplification（LAMP） for visual detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）， in order to provide support for early diagnosis of nuclear polyhedrosis at work field. 【Method】Taking BmNPV polyhedrin gene polh as amplification target， five groups of inner primer/outer primer and five pieces of loop primer were designed in order to screen the best primer combination based on amplification efficiency. LAMP reaction conditions were optimized and assays on specificity， sensibility as well as clinical sample detection were conducted. The amplification result was observed by colorimetric determination with hydroxynaphthol blue （HNB） staining. The conditions for simplifying treatment were analyzed. 【Result】When using LAMP of loop primer， the lowest detection line of BmNPV genomic DNA could reach 7 fg/μl， the sensitivity of detection was improved effectively and reaction time was reduced. The established LAMP detection specifically amplified the target DNA， and its sample detection rate was superior to conventional PCR. The lowest detection line was as 100 times as that of conventional PCR. The result could be easily judged and the cross-contamination could be reduced by adding HNB before reaction. The hemolymph of infected silkworm boiled at 100 ℃ could be directly applied to LAMP， which could simplify operation steps and reduce detecting cost. 【Conclusion】The visual LAMP detection targeting BmNPV established in this study is sensitive， quick and reliable， which is appropriate to use for early diagnosis of BmNPV infection at work field.

Key words： Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）； nuclear polyhedrosis； LAMP； early diagnosis； visua-

lization

0 引言

【研究意義】家蚕血液型脓病是广西养蚕业中最常见及危害最严重的一种病毒性传染病，由于传染性强、病死率高，且目前尚无有效的治疗方法，对蚕茧生产造成巨大经济损失。家蚕血液型脓病病原为家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV），其特点是病毒粒子可在多角体结构的保护下长期保存感染活力，病毒多角体在自然环境中广泛富集，极易对桑叶和蚕作环境造成污染。BmNPV多角体被蚕体摄食后即引起原发性感染，继而传播感染蚕室内的其他健康蚕体（Fuxa，2004；Liang et al.，2013）。因此，建立针对BmNPV的特异、灵敏、快速、适合基层使用的可视化检测技术，对有效防控家蚕血液型脓病暴发流行及减少病毒多角体在生产环境中的富集具有重要意义。【前人研究进展】分子生物学诊断技术是近年来蚕病诊断研究的新方向，主要是基于聚合酶链反应（PCR）对病原微生物核酸进行扩增克隆。目前，国内已有关于BmNPV检测常规PCR（涂纳新等，1994；刘吉平等，2011；唐芬芬等，2013b）、实时荧光定量PCR（姚勤等，2005）、二温式PCR（覃玥和陈保善，2015）和多重PCR（专利号CN102605106A，浙江省检验检疫科学技术研究院）的研究报道；也有关于环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测技术的报道，但未涉及扩增效率的改善（唐芬芬等，2013a；覃玥等，2015）。本课题组通过对BmNPV多角体蛋白基因polh进行常规PCR扩增和测序分析，获得了广西多个毒株的polh基因序列信息（Liang et al.，2013），为LAMP的靶标选择和引物设计打下了基础。LAMP是一种操作简单、反应快速、高度特异和灵敏的核酸扩增技术（Nimitphak et al.，2000），自其问世以来，经过不断的优化和改进，目前已广泛应用到不同领域的生物基因检测及鉴别研究，如畜禽病原微生物LAMP检测方法的建立为生产现场的快速诊断提供了技术支持（Liu et al.，2011；彭宜等，2013；Pawar et al.，2014；Xie et al.，2014；邓显文等，2015；胡成等，2015；潘宏等，2015）。【本研究切入点】目前生产上对家蚕血液型脓病的诊断主要依靠典型病征的肉眼观察诊断，但BmNPV感染家蚕后的病程与家蚕龄期、病毒数量和毒力、饲养环境及家蚕体质等因素有关，且该病为亚急性传染病，可确诊时期通常已发展到感病晚期，因此亟需建立一种特异、灵敏、快速、适合基层使用的可视化检测技术。【拟解决的关键问题】建立针对BmNPV的LAMP检测技术，为生产开展家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持，及时发现病情并采取有效防治措施，控制该病的扩散传播。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

BmNPV病毒、家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosisvirus，BmCPV）、家蚕微孢子虫（Nosemabombycis，N.b）、灵菌败血病菌（Serratia marcescens，S.m）、白僵病菌（Beauveria bassiana，B.b）由广西大学农学院蚕病研究室保存提供，DNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，ExTaq购自宝生物工程（大连）有限公司，Bst DNA聚合酶、甜菜碱（Betaine）、MgSO4、dNTPs、钙黄绿素（Calcein）、MnCl2等购自荣研（中国）生物科技有限公司，羟基萘酚蓝（HNB）购自上海源叶生物科技有限公司。主要仪器设备：分光光度计Thermo Scientific NANODROP 1000购自Scientific Thermo公司，LA-320C实时浊度仪购自日本Eiken Chemical公司。

1. 2 LAMP引物设计与合成

根据BmNPV标准参考毒株日本T3株（GenBank登录号L33180.1）的polh基因序列，使用LAMP引物设计辅助软件Primer Explorer V4进行在线设计。分别设计5组内/外引物和5条环引物，再根据扩增效率筛选最佳引物组合。所有引物由广州华大基因科技股份有限公司合成。

1. 3 DNA提取及阳性质粒构建

按本课题组建立的方法提取所有试材DNA，以分光光度计测定DNA浓度。采用常规PCR扩增BmNPV的polh基因完整ORF，将目的基因连接至pMD18-T载体，构建阳性质粒pMD18-polh，测序验证模板的准确性（Liang et al.，2013）。

1. 4 LAMP反应条件优化

将反应温度从60 ℃逐步提高至65 ℃，选择最佳反应温度。确定反应温度后对反应体系进行优化，在不同浓度的反应组分（2～12 mmol/L MgSO4、0.2～1.2 mol/L Betaine、0.6～1.6 mmol/L dNTPs）和不同反应时间（20、40、60和80 min）条件下，在LA-320C实时浊度仪中进行LAMP反应，每隔6 s测定1次浊度值。根据浊度值绘制浊度变化曲线，当浊度值大于0.25即可判为阳性。

1. 5 环引物使用效果试验

将阳性质粒进行10倍梯度稀释（10-8～10-1），以此为模板分别进行两组LAMP反应，一组使用环引物，另一组不使用环引物，浊度仪实时测定反应浊度的变化。

1. 6 LAMP特异性试验

分别对BmNPV、BmCPV、N.b、S.m和B.b的DNA进行LAMP检测，以健康家蚕的血细胞DNA为对照（CT），浊度仪实时测定反应浊度的变化。

1. 7 LAMP敏感性试验

将BmNPV基因组DNA进行10倍梯度稀释（10-8～ 10-1），以此为模板分别进行LAMP和常规PCR检测，浊度仪实时测定LAMP反应的浊度值变化。常规PCR使用外引物F3/B3进行扩增，反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。

1. 8 临床样本检测试验

分别采用LAMP和常规PCR对25份蚕病样本的DNA进行检测，比较两种检测方法的检出率。LAMP反应结果可视化判断，即在反应体系中加入120 μmol/L HNB，或加入20 μmol/L Calcein和0.5 mmol/L MnCl2，自然光下观察染色结果。

1. 9 简化样本处理试验

取1.6×108 OBs/mL的BmNPV多角体接种5龄起蚕，接种后第6 d采集感染家蚕的血淋巴，以等量超纯水稀释，分成两组。一组添加多角体裂解缓冲液（0.2 mol/L Na2CO3+0.32 mol/L NaCl），另一组不添加多角体裂解缓冲液，然后分别对两组样品进行5种不同处理：①100 ℃煮沸10 min，使细胞破裂，蛋白变性；②加入1/10体积的10% SDS于55 ℃下作用1 h；③加入1/20体积的蛋白酶K于55 ℃下作用1 h；④加入1/10体积的10% SDS和1/20体积的蛋白酶K于55 ℃下作用1 h；⑤抽提DNA。12000 r/min离心10 min，各取2 μL上清液作为模板进行LAMP检测。

2 结果与分析

2. 1 LAMP引物筛选及反应条件优化结果

以携带polh基因的阳性质粒pMD18-polh为模板，分别使用5组LAMP引物的外引物进行常规PCR扩增预试验，结果发现均能扩增出目的片段。再使用5组内/外引物在同等条件下进行LAMP检测，结果显示有4组内/外引物能实现扩增反应，根据浊度值变化曲线可看出，第3组引物扩增的浊度值变化速率最大，表现为阳性扩增反应最快、反应用时最短（图1-A）。在选择扩增效率最高的第3组内/外引物基础上，再分别使用5条环引物进行LAMP检测，结果显示，5条环引物均能使扩增效率进一步提高，其中以第2条环引物的提高效果最明显，浊度值达阳性判定标准最快，与未使用环引物反应相比，用时缩短近一半（图1-B）。因此，选择第3组内/外引物和第2条环引物作为最佳的LAMP引物组合（表1）。对LAMP反应条件进行优化，确定最优反应体系为25.0 μL：F3和B3引物各5 pmol，FIP和BIP引物各40 pmol，LP引物20 pmol，0.6 mol/L Betaine，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA聚合酶，1.0 μL模板DNA；于63 ℃下恒溫反应60 min，90 ℃灭活5 min。

2. 2 环引物使用效果比较结果

以10倍梯度稀释的阳性质粒为模板进行LAMP检测，结果显示，不使用环引物的LAMP反应最低稀释度为10-5，且在反应开始约28 min时检测到有polh基因的扩增（图2-A）；使用环引物的LAMP反应最低稀释度为10-6，最低检测限是不使用环引物的10倍，且在反应开始约15 min时即检测到有polh基因的扩增，较不使用环引物约提前1倍（图2-B）。说明使用环引物不仅能使LAMP反应时间缩短，还有利于提高其检测敏感性。

2. 3 特异性试验结果

由LAMP检测的浊度变化曲线可知，BmCPV、N.b、S.m和B.b的LAMP检测结果均呈阴性，对健康家蚕血细胞（CT）的DNA扩增也呈阴性，仅对BmNPV的DNA产生扩增反应，且浊度快速达到阳性判断标准，表明建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性。

2. 4 敏感性试验结果

经分光光度计测得基因组DNA浓度为70 ng/μL，进行10倍梯度稀释后，以不同浓度的DNA稀释液为模板分别进行LAMP和常规PCR检测。浊度变化曲线（图3-A）显示，LAMP检测的最低稀释度为10-7，即最低DNA浓度为7 fg/μL。常规PCR检测的最低稀释度为10-5（图3-B），即最低DNA浓度为700 fg/μL。LAMP的最低检测限是常规PCR的100倍，表明LAMP检测的敏感性高于常规PCR。

2. 5 临床样本检测结果

阳性LAMP反应过程中会产生副产物——焦磷酸镁白色沉淀，因此反应结束后的反应液变混浊，静置或低速离心反应管，在管底可见白色沉淀。以HNB染色时，自然光下可见阳性反应液呈浅蓝色，阴性反应液呈较深的蓝紫色；采用钙黄绿素和MnCl2染色时，阳性反应液呈浅绿色，阴性反应液呈浅橘色（图4）。为了验证LAMP检测的稳定性和实用性，分别采用LAMP和常规PCR对25份蚕病样本的DNA进行检测，比较两种检测方法的检出率，结果表明，LAMP共检测到21份BmNPV阳性样本，常规PCR仅检测出17份BmNPV阳性样本。说明LAMP的检出率高于常规PCR，尤其对于混合感染的样本，微量的BmNPV DNA也能通过LAMP检测出来。

2. 6 简化样本处理试验结果

对BmNPV感染的家蚕血淋巴进行100 ℃煮沸10 min和抽提DNA处理，结果发现添加多角体裂解缓冲液与否均会出现阳性扩增反应，但不添加多角体裂解缓冲液的处理在反应开始约16 min即产生扩增（图5-A），而添加多角体裂解缓冲液的处理在反应开始44 min后才出现扩增（图5-B）。抽提DNA的处理均在反应开始12 min左右产生扩增；添加多角体裂解缓冲液的煮沸处理样本，LAMP扩增反应起始较慢，可能是由于强碱性裂解样本改变了反应体系的性质，对Bst DNA聚合酶的活性产生影响；其他3种处理方式的LAMP检测结果均为阴性，推测SDS和蛋白酶K对Bst DNA聚合酶造成了变性破坏，使其功能受损。

3 讨论

LAMP内/外引物可识别靶基因6个不同区域的核酸序列，其设计较常规PCR复杂，对特异性要求较高。Nagamine等（2002）研究发现，在LAMP反应中加入环引物能够明显加快扩增速度，缩短反应时间，还能提高检测的灵敏度。LAMP检测的关键是靶标基因选择与引物筛选。在线设计LAMP引物时会产生多组引物可供选择，除了根据引物的Tm、GC含量、末端稳定性等进行筛选外，反应时间和效率也是决定引物优劣的重要因素。在唐芬芬等（2013a）、覃玥等（2015）的BmNPV可视化LAMP方法建立研究中，都只设计1组LAMP引物进行试验，未对LAMP引物进行筛选。本研究设计并合成了5组特异性的LAMP内/外引物和5条环引物，经验证发现有4组LAMP内/外引物能实现扩增反应，而5条环引物均能不同程度改善反应效率，表明同一靶标基因的LAMP引物，结合位点不同，其反应效率也存在差别，因此需根据反应快慢和扩增速率筛选最佳引物组合。本研究通过浊度仪实时监测反应进程，能够具体了解反应起始快慢和扩增速率等信息，为引物筛选优化提供了依据。此外，利用筛选的最佳引物组合，对常见家蚕病原微生物进行LAMP检测，以排除交叉反应的可能，结果显示筛选出的最佳引物组合仅对靶标DNA的扩增具有特异性。

BmNPV的polh基因是病毒极晚期超量表达的结构蛋白基因，编码的多角体蛋白组装形成多角体晶体结构。Xu等（2013）通过对不同BmNPV毒株的基因组进行比较，发现polh基因的保守性高于pe38基因。虽然与覃玥等（2015）的研究都选择polh基因作为靶标基因，但本研究设计还使用了环引物，对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7 fg/μL，明显低于覃玥等（2015）的研究结果（25 fg/μL），检测敏感性得到改善。此外，使用环引物的LAMP反应时间比不使用环引物的缩短近一半，有效提高了反应效率，且检出率高于常规PCR。BmNPV对家蚕中肠细胞造成原发性感染后，产生的子代病毒即进入血腔侵染血细胞和其他易感组织细胞，受感染细胞崩解，细胞碎片被释放进血腔，病毒随之释放到血液中。本研究将感染的血淋巴进行煮沸处理，使其中的血细胞和崩解组织细胞破裂，蛋白变性，病毒DNA暴露，离心后上清液可直接用于LAMP检测，且扩增效率与抽提DNA的相近。该处理方法免除了DNA抽提步骤，更有利于生产现场的快速检测。

LAMP检测灵敏度高，但易受反应产物形成的气溶胶污染而产生假阳性结果。本研究采用浊度仪实时监测LAMP反应，由于采用闭管扩增，可从源头上控制气溶胶污染。LAMP检测结果可用肉眼观察反应液中的白色沉淀出现与否进行判断（Mori et al.，2001），但有时会存在一定误差。染色检测法是通过添加染料指示剂使反应液颜色差别明显，易于目视判定反应结果（Tomita et al.，2008；Goto et al.，2009）。Goto等（2009）研究表明，使用金属离子染色剂HNB对LAMP反应产物进行染色，不但在自然光下易判断结果，而且检测灵敏度高于钙黄绿素染色、接近SYBR GreenⅠ染色。本研究采用的HNB染色既能保證检测的灵敏度，又能降低假阳性风险，有效解决了LAMP检测技术在生产现场的可视化使用问题。

本研究建立的BmNPV可视化LAMP检测技术通过使用环引物改善了灵敏度，并缩短了反应时间，对常见的家蚕病原微生物不产生交叉反应，且检出率高于常规PCR，具有良好的特异性和实用性，采用HNB染色的结果易判定。此外，通过简化样本处理，使操作更便捷、成本更低，适合生产现场对BmNPV的快速检测，为基层对家蚕血液型脓病的早期诊断和预防控制提供了技术支持。

4 结论

针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点，适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断，对及时发现病情并控制传播范围、减少病毒多角体在生产环境中富集、保障养蚕业持续稳定发展具有积极作用。

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（责任编辑 兰宗宝）