家兔肠道微生物ERIC—PCR指纹图谱构建及分析

曾波　张智　李再新

摘要：【目的】構建不同周龄健康家兔及腹泻家兔肠道微生物的ERIC-PCR指纹图谱，分析二者肠道菌群结构的多样性及其差异性，为优化家兔饲养和疾病防治打下基础。【方法】收集1～8周龄健康家兔与腹泻家兔粪便样本，分离肠道微生物并提取其基因组DNA，PCR扩增其16S rDNA与ERIC，构建ERIC-PCR指纹图谱，对不同周龄健康家兔及腹泻家兔肠道菌群结构进行分析。【结果】肠道微生物迅速在1周龄仔兔肠道中定植且总量达最高值，其后不断减少，5周龄后总量趋于稳定，且1周龄仔兔与5周龄后（断奶后）家兔的肠道微生物总量间均存在显著差异（P<0.05）。随着周龄的增加，肠道微生物ERIC条带特征发生明显变化，各周龄出现了不同的特征性ERIC条带。与同一周龄健康家兔相比，腹泻家兔肠道微生物ERIC条带明显减少，条带特征存在明显差异，菌群多样性低于健康家兔。【结论】随着周龄的增加，健康家兔的肠道微生物菌群结构和多样性发生明显变化。与同一周龄健康家兔相比，腹泻家兔肠道微生物菌群结构明显改变，多样性明显降低，且出现健康家兔中未出现过的优势菌群，进一步证明肠道微生物菌群结构与家兔生长发育和腹泻存在关联性。

关键词： 家兔；肠道微生物；菌群结构；ERIC-PCR；腹泻

中图分类号： S858.291 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0139-05

Abstract：【Objective】The present study was conducted to construct intestinal microbial ERIC-PCR fingerprint of healthy rabbits and diarrheal rabbits and analyze structural difference between their intestinal microbial communities， in order to lay a foundation for optimizing rabbit feeding and disease control. 【Method】Intestinal microbes were isolated from fecal samples which was collected from 1-8 week-old healthy rabbits and diarrheal rabbits， and their genomic DNA was extracted. Then 16S rDNA and ERIC were amplified by PCR technique. ERIC-PCR fingerprint was further constructed to analyze structure of intestinal microbial community in different week-old healthy rabbits and diarrheal rabbits. 【Result】Intestinal microbes colonized quickly in 1 week-old rabbits， and total quantity of intestinal microbes reached the highest level， thereafter total quantity of intestinal microbes began to reduce， and became stable after 5 weeks old. And there were some significant differences in total quantity of intestinal microbes between 1 week-old rabbits and more than 5 week-old（after weaning） rabbits（P<0.05）. Characteristic ERIC bands changed obviously with increase of week age， different characteristic ERIC bands were found in different week-old rabbits. Compared with age-matched healthy rabbits， number of ERIC bands in diarrheal rabbits was reduced markedly， and characteristics of ERIC bands were also markedly different， and diversity of intestinal microbial communities in healthy rabbits were lower than that in diarrheal rabbits. 【Conclusion】With increase of week age， structure and diversity of intestinal flora in healthy rabbits change obviously. Compared with age-matched healthy rabbits， structure of intestinal microbial communities of healthy rabbit changes obviously， and diversity is also reduced， but dominant bacterial communities which do not appear in healthy rabbits are found in diarrheal rabbits. It is suggested that structure of intestinal microbial communities is significantly correlated with development and diarrhea of rabbits.

Key words： rabbit； intestinal microbiotas； microbial community structure； ERIC-PCR； diarrhea

0 引言

【研究意义】肠道微生物在宿主消化、免疫和抗病等方面发挥着不可替代的作用，肠道菌群失调可能导致自身免疫性疾病、肥胖、过敏反应等疾病（童雨心和梁迎春，2014），尤其是肠道菌群结构的改变与人和动物腹泻存在关联性（刘开朗等，2007；李琳和李岩，2014；童雨心和梁迎春，2014）。因此，了解肠道菌群结构变化与家兔生长发育、罹患腹泻的关联性对家兔的饲养和疾病防治具有重要意义。【前人研究进展】传统的微生物分类鉴定方法主要基于其表型特征，如生长特性、生理生化、血清型等（Popoff et al.，1998；吴清平等，2006；张国林和景荣先，2014）。但受动物年龄、食物、断奶和健康状况等因素的影响，肠道微生物菌群组成极易发生变化，且绝大多数肠道微生物至今仍缺乏有效的分离培养方法，致使传统的分类鉴定方法在分析肠道菌群结构方面存在一定的局限性（汤文杰等，2016）。目前，一些基于微生物遗传物质分类鉴定的分子生物学方法，如ERIC-PCR、DGGE、RAPD-PCR、RFLP及复合PCR等（Cao et al.，2008；杨柳等，2011；伊丽娜等，2014；范志宇等，2015；Zeinali et al.，2015），有效规避了传统分类鉴定方法的不足。其中，ERIC-PCR是根据ERIC高度保守序列设计引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，构建DNA指纹图谱，并通过构建的ERIC-PCR指纹图谱，建立快速检测的分子分型平台，具有灵敏度高、重复性好、可靠性强、省时省力等优点，现已广泛应用于微生物分类鉴定、环境微生物动态分析等研究领域（Peng et al.，2007；Cao et al.，2008）。胡波等（2016）采用ERIC-PCR分析流行性腹胀家兔的肠道菌群结构，结果发现患病家兔肠道微生物多样性降低，且存在特定的肠道优势菌群。李云飞等（2016）通过构建ERIC-PCR指纹图谱并用于家兔粪便中微生物的鉴定分析，从而建立了一种可快速分析检测家兔肠道菌群结构变化的方法。【本研究切入点】虽然ERIC-PCR已应用于家兔肠道微生物DNA指纹图谱的构建，但鲜见运用该技术进行不同周龄家兔及腹泻家兔肠道微生物DNA指纹图谱构建并比较二者肠道菌群结构差异的文献报道。【拟解决的关键问题】运用ERIC-PCR构建家兔肠道微生物DNA指纹图谱，并分析肠道微生物结构在低龄家兔生长发育过程中的变化，比较健康家兔和腹泻家兔肠道菌群结构的差异，确定与家兔生长发育和腹泻相关的特征性肠道菌群，为探究家兔肠道微生物结构变化与其生长发育和健康状况间的关联性提供参考，为优化家兔饲养和疾病防治打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试家兔由四川自贡市某家兔场提供。DNA Stool Mini Kit购自QIAamp公司；dNTP、pfu酶、PCR Buffer、DNA Marker等购自Thermo公司；50×TAE购自南京美博生物科技有限公司；Gelview核酸染料购自北京百泰克生物技术有限公司。16S rDNA和ERIC的特异性引物均由华大基因科技有限公司合成。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 引物设计与合成 参照Versalovic等（1991）的方法设计ERIC特异性引物，上游引物ERIC-F：5'-

ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAA-3'；下游引物ERIC-

R：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。细菌16S rDNA引物为通用引物，上游引物27F：5'-AGAGTTTG

ATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492R：5'-TACGGCT

ACCTTGTTACGACTT-3'。

1. 2. 2 粪便收集 选取6只刚出生的仔兔（来自不同母兔），前4周与其母兔同窝喂养母乳兼饲料，第5周后断奶，饲喂饲料至第8周。从母乳喂养1周后，每周收集每只仔兔粪便6 g至8周龄。另外，选取4只7～8周龄未使用过抗生素类药物的腹泻家兔，在出现腹泻的第2 d收集其粪便。

1. 2. 3 肠道微生物分离 在收集的不同周龄健康家兔及腹泻家兔粪便中分别加入60.0 mL无菌PBS，重悬粪便中的微生物，过滤除去大颗粒杂质，再用60.0 mL无菌PBS冲洗滤渣，合并两次滤液至灭菌的离心管中，800 r/min离心5 min，取上清液，10000 r/min离心5 min，弃上清液，用1.0 mL无菌PBS重悬沉淀，移至1.5 mL离心管中，10000 r/min离心5 min，弃上清液，即得家兔肠道微生物初提物，称其质量，并加入30%甘油于-80 ℃保存备用。

1. 2. 4 基因组DNA提取 分别取同一周龄6只仔兔肠道初提物各2 mg，充分混合后，参照DNA提取试剂盒说明提取肠道微生物的基因组DNA，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 2. 5 PCR扩增 测定基因组DNA浓度，将同一周龄健康家兔基因组DNA等量混合，以5 ng混合基因组DNA为模板，分别PCR扩增16S rDNA和ERIC。16S rDNA扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s，进行32个循环；72 ℃延伸10 min。ERIC扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 8 min，进行35个循环；65 ℃延伸18 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1. 3 統计分析

應用SPSS 17.0对兔肠道微生物的初提物质量进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 健康家兔肠道微生物的分离结果

从收集得到的1～8周龄健康家兔粪便样品中分离肠道微生物，结果如图1所示，每克家兔粪便的肠道微生物初提物中，微生物总量随周龄的增长整体上呈减少趋势，1周龄仔兔肠道微生物的总量最高，其后不断减少，5周龄后总量趋于稳定，且1周龄仔兔与5周龄后（断奶后）家兔的肠道微生物总量间均存在显著差异（P<0.05）。

2. 2 家兔肠道微生物基因组DNA的提取结果

家兔肠道微生物基因组DNA的提取结果如图2所示，从不同周龄家兔肠道微生物初提物中均能提取到条带较单一且完整的基因组DNA。

2. 3 家兔肠道微生物16S rDNA的PCR扩增结果

以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增16S rDNA，结果如图3所示，扩增条带大小与预期一致，表明提取的基因组DNA可作为模板进行下一步的ERIC- PCR分析。

2. 4 家兔肠道微生物ERIC-PCR指纹图谱分析结果

通过构建ERIC-PCR指纹图谱并分析家兔肠道微生物种类菌群结构变化，结果如图4所示。家兔ERIC丰量随周龄的增加而发生明显变化，No.1 ERIC条带在1周龄家兔中丰量最高，3周龄后逐渐减少，在8周龄家兔中几乎检测不到；No.2 ERIC条带在1周龄家兔中几乎检测不到，2周龄后其丰量急剧升高，6周龄后有所下降并趋于稳定，且在腹泻家兔中亦可检测到；No.3 ERIC条带丰量从1周龄逐渐升高，4周龄达最高值，之后急剧降低；No.4 ERIC条带从5周龄才出现，之后其丰量持续增加。

将健康家兔与腹泻家兔的ERIC条带进行比较，结果（图4和图5）发现，与同一周龄健康家兔相比，腹泻家兔肠道微生物的ERIC条带数目明显减少，除No.2 ERIC条带被检出外，腹泻家兔与健康家兔ERIC条带特征无一致性，且腹泻家兔间ERIC条带一致性也较差。此外，从腹泻家兔中均检出多条大小明显低于No.2 ERIC的条带（No.5 ERIC条带），但条带在健康家兔中几乎检测不到。

3 讨论

自Versalovic等（1991）首次设计了ERIC的特异性引物并用于分析细菌基因组DNA指纹图谱以来，该技术已广泛应用于微生物分类鉴定研究，如罗永久等（2014）研究发现同一食性动物的肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱条带相似性较不同食性动物间更高，表明食物来源对肠道菌群结构有较大影响；刘毅等（2015）利用ERIC-PCR能快捷准确地区分不同菌株系。上述研究证实，ERIC-PCR同样可用于分析家兔肠道微生物菌群结构。本研究初步构建了不同周龄健康家兔及腹泻家兔肠道微生物的ERIC-PCR指纹图谱，并对其肠道菌群结构变化进行分析，结果发现，自家兔出生后微生物在其肠道迅速定植，微生物总量达峰值，且菌群多样性丰富，随着家兔周龄的增加，微生物总量和菌群生物多样性逐渐下降，部分特征性肠道菌群定植率逐渐降低，甚至消失，其生理功能作用有待深入研究。当仔兔断奶后，其肠道微生物ERIC条带发生改变，表明菌群结构发生变化，由此推测从母乳过渡到饲料喂养对家兔肠道菌群结构有较大影响。但某些微生物在肠道定植后，便永久寄居，即使在腹泻家兔中仍能检出。由此推测，这些微生物可能与养分的吸收代谢等过程相关联，为家兔肠道的看家菌群。8周龄家兔肠道菌群出现较明显的特征性ERIC条带，表明该周龄家兔肠道已形成了成年家兔相关的优势菌群。李云飞等（2016）在健康德国花巨兔肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱中发现了450 bp双歧杆菌特征性条带，但在本研究构建的ERIC-PCR指纹图谱中并未发现该条带。在后续研究中，应纯化ERIC特征性条带并对其进行测序分析，且分离鉴定出对应的家兔肠道微生物，并分析微生物在家兔生长发育过程中的作用。

目前，已有大量研究证明，肠道菌群结构变化与宿主发生腹泻存在极显著相关（宋玉财等，2013；刘海燕等，2014）。本研究通过对比腹泻家兔与健康家兔肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱，结果发现二者在家兔肠道菌群结构上存在明显差异。除了腹泻家兔肠道微生物总量和ERIC条带数目明显减少，ERIC条带特征不同于健康家兔，其ERIC条带大小明显偏低等现象外，还出现一些大小低于No.2 ERIC的条带，如No.5 ERIC条带，但在健康家兔中几乎检测不到。此外，本研究通过比对腹泻家兔个体间的ERIC-PCR指纹图谱，发现腹泻家兔个体间肠道菌群结构存在一定差异，表明腹泻家兔肠道菌群结构发生了明显改变，出现了新的外来优势菌群，与胡波等（2016）的研究结果相近。说明肠道菌群结构与家兔腹泻密切相关，但其致病性有待进一步研究。

4 结论

随着周龄的增加，健康家兔的肠道微生物菌群结构和多样性发生明显变化。与同一周龄健康家兔相比，腹泻家兔肠道微生物菌群结构明显改变，多样性明显降低，且出现健康家兔中未出现过的优势菌群，进一步证明肠道微生物菌群结构与家兔生长发育和腹泻存在关联性。

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（責任编辑 陈 燕）