金花葵多糖提取的工艺优化及抗氧化活性研究

巫玲丽　穆祯强　张利

摘要：【目的】优化金花葵多糖的提取工艺，考察金花葵多糖的抗氧化活性，为金花葵多糖的研究和利用提供参考依据。【方法】以金花葵多糖提取率为评价指标，在单因素试验基础上，采用L9（33）正交试验优化超声辅助提取工艺，通过对DPPH自由基和羟基自由基（·OH）清除能力的考察评价金花葵多糖的体外抗氧化活性。【结果】影响超声辅助提取金花葵多糖效果的因素排序为：超声时间>料液比>超声温度，其最佳提取工艺条件为：料液比1∶50、超声时间30 min、超声温度50 ℃，在此条件下金花葵多糖的提取率为22.32%。自由基清除试验结果表明，金花葵多糖对DPPH自由基和·OH的清除率呈现剂量依赖性。【结论】优化得到的金花葵多糖提取工艺操作简单可行，提取的金花葵多糖具有较强抗氧化活性，该工艺可在金花葵多糖的提取研究和开发利用中应用。

关键词： 金花葵；多糖；超声提取；抗氧化活性

中图分类号： TQ461 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0109-05

Abstract：【Objective】The extraction process of polysaccharides from Hibiseu smanihot L. was optimized，and its antioxidant activity was investigated，in order to provide basis for research and utilization of polysaccharides from H. smanihot L. 【Method】Taking extraction rate of H. smanihot L. polysaccharides as index， and on the basis of single factor experiment，the extraction technology assisted by ultrasonic was optimized by L9（33） orthogonal test. The antioxidant activities of H. smanihot L. polysaccharides were evaluated through scavenging experiment on DPPH free radical and the hydroxyl free radical（·OH）. 【Result】The three factors affecting ultrasonic-assisted extraction of H. Smanihot L. polysaccharides were in order as follows：ultrasonic time>material-liquid ratio>ultrasonic temperature. The optimum extraction process parameters of polysaccharides were as follows material-liquid ratio 1∶50，ultrasonic time of 30 min， ultrasonic temperature 50 ℃. Under such condition， the extraction rate reached 22.32%. Free radical scavenging experiment showed that scavenging effects of H. Smanihot L. polysaccharides towards DPPH free radical and ·OH varied according to the dosage. 【Conclusion】The optimized extraction process of H. Smanihot L. polysaccharides is simple，convenient and feasible. And H. Smanihot L. polysaccharides has strong antioxidant activity. This processing technique can be applied in extraction and development of H. Smanihot L. polysaccharides.

Key words： Hibiseu smanihot L.； polysaccharides； ultrasonic extraction； antioxidant activity

0 引言

【研究意义】金花葵（Hibiseu smanihot L.）又名菜芙蓉、野芙蓉，是一年生草本植物，既可药用又可食用，根、秆、花、叶和果均可利用，还可作观赏植物，被称为“植物界大熊猫”，近年来已在多地推广种植。植物多糖具有降血糖和血脂（罗祖友等，2007）、免疫调节（尚庆辉等，2015）、抑制恶性黑素瘤（马文宇和吴邓婷，2016）等生物学功能。黄秋葵多糖有抗氧化活性，但对与其同属金花葵中多糖活性的研究未见报道。因此，优化金花葵多糖的提取工艺并考察其抗氧化活性，对金花葵多糖的研究和利用具有重要意义。【前人研究进展】梅洪睿等（2009）鉴别结果表明，金花葵种子中含有生物碱。王刚和姚佳（2010）采用水蒸气蒸馏法从金花葵子中提取挥发油，用气相色谱—质谱法对其化学成分进行分离鉴定，结果表明，金花葵子挥发油的主要成分为亚油酸（10.74%）、软脂酸（42.01%）和顺-9-烯-十八烷酸（8.14%）。劉琦（2012）应用高速逆流色谱法分离金花葵花中两种黄酮类化合物，结果表明，从100.3 mg金花葵花总黄酮纯化物中分离得到金丝桃苷10.07 mg，纯度达94.194%；葛根素13.5 mg，纯度达94.579%。赵焕焕（2012）采用水提醇沉法提取黄秋葵多糖，并用蒽酮—硫酸法测定RPS含量，应用1，1-二苯基苦味酰基苯肼、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法检测多糖活性，结果表明，黄秋葵中多糖含量较高且对3种自由基的清除率呈现剂量依赖性。【本研究切入点】目前，关于金花葵多糖提取及其体外抗氧化活性的研究未见报道。【拟解决的关键问题】优化金花葵多糖提取工艺，并考察提取的金花葵多糖抗氧化活性，为金花葵多糖的研究、开发和利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

金花葵干花苞购自河南新乡。试验使用的仪器及药剂：数控超声波装置（KQ-300DE型，昆山市超声仪器有限公司）；紫外—可见分光光度计（752，上海光学仪器有限公司）；水浴锅（OSB-2100，上海爱朗仪器有限公司）；双循环水式多用真空泵（CA-1115，上海爱朗仪器有限公司）；旋转蒸发仪（N-1100，上海爱朗仪器有限公司）；DPPH（美国Sigma公司）；葡萄糖标准品无水乙醇、邻苯三酚、三（羟甲基）氨基甲烷、苯酚、硫酸、水杨酸、双氧水和硫酸亚铁均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1. 2 标准曲线绘制

参考罗泽萍等（2015）的方法，称取干燥至恒重的葡萄糖标准品250.0 mg置于250 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度。分别吸取质量浓度1.0 mg/mL葡萄糖标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL于6个100 mL容量瓶中定容，备用。再分别吸取这6种浓度溶液2.0 mL于25 mL比色管中，以蒸馏水作参比，依次加入新配制质量分数为5%的苯酚溶液1.0 mL，混匀，再缓慢加入5.0 mL浓硫酸，摇匀后静置5 min，在沸水浴中加热15 min后冷却至室温。在200～800 nm范围内扫描波长，得出在490 nm处的吸收最强，故在490 nm处测定吸光值，以葡萄糖质量浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光值A為纵坐标绘制标准曲线。

1. 3 金花葵多糖提取工艺优化

1. 3. 1 金花葵多糖提取 金花葵在70 ℃下干燥24 h，粉碎，过80目筛备用。取1.000 g金花葵花粉，以蒸馏水为溶剂，在一定料液比、超声时间及超声温度条件下超声提取金花葵多糖。提取液经离心，取上清液减压浓缩，加入无水乙醇至终浓度80%，醇沉过夜，离心，取下层沉淀，无水乙醇洗涤数次，冷冻干燥即得金花葵粗多糖。

1. 3. 2 单因素试验 称取1.000 g金花葵粉，分别以料液比、超声时间和超声温度为单一变量，对金花葵多糖提取率进行单因素试验。

1. 3. 3 正交试验 在单因素试验的基础上，料液比、超声时间和超声温度分别取3个水平进行正交试验，优化金花葵多糖的超声提取工艺。正交试验水平和因素见表1。

1. 4 金花葵多糖抗氧化活性测定

1. 4. 1 DPPH自由基清除 分别取不同量多糖，用超纯水溶解，并按1.2方法测得其浓度分别为3.290、1.645、0.823、0.412和0.206 mg/mL，称取阳性对照品维生素C（Vc）配制为相同浓度溶液。称取DPPH 0.0040 g，用乙醇溶液溶解定容至100 mL棕色瓶中，得0.1 mmol/L DPPH溶液，避光保存备用。参考赵焕焕等（2012）的方法，分别取1.0 mL不同浓度金花葵多糖溶液于比色管中，再加入2.0 mL DPPH溶液，摇匀后置于暗处30 min，于517 nm处测定吸光值Ai；同时设空白组A0（1.0 mL蒸馏水代替样品溶液）和样底组Aj（2.0 mL乙醇溶液代替DPPH溶液），3次重复，求其平均值，计算清除率。清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0 ×100。以同等条件测得Vc对DPPH自由基的清除率。

1. 4. 2 羟基自由基（·OH）清除 参考杨申明等（2015）的方法，分别取不同量多糖，用超纯水溶解，并按1.2方法测得其浓度分别为4.110、3.425、2.740、2.060和1.370 mg/mL，称取阳性对照品Vc配制为相同浓度溶液。在11支比色管中依次加入1.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1.0 mL 6 mmol/L水杨酸乙醇溶液和1.0 mL不同浓度的样品溶液，最后再加入1.0 mL 5 mmol/L H2O2溶液摇匀，37 ℃水浴中静置30 min，在510 nm处测吸光值A1。以1.0 mL水代替样品测得吸光值A0，以1.0 mL水代替H2O2测得吸光值A2。用同样方法测得对照品Vc的清除率。

清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100

2 结果与分析

2. 1 葡萄糖标准曲线

以不同质量浓度葡萄糖对照品测得的吸光值建立回归方程：y=14.203x-0.0079（R2=0.9993），葡萄糖在质量浓度0.01～0.06 mg/mL范围内与吸光值有良好的线性关系（图1）。

2. 2 单因素试验结果

2. 2. 1 不同料液比对金花葵多糖提取率的影响 取1.000 g金花葵粉末，以料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60，固定超声温度60 ℃，超声30 min过滤取上清液，浓缩至一定体积，加无水乙醇使乙醇浓度达到80%，静置过夜析出多糖，再用无水乙醇洗涤数次，冷冻干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法测定多糖含量，并计算提取率。由图2可看出，料液比对金花葵多糖提取的影响分两个阶段，以1∶40为界，1∶40前随着料液比的降低提取率升高，1∶40后随着料液比的降低提取率降低，但总体上低料液比的提取率比高料液比高，因此选择1∶40、1∶50和1∶60作为正交优化试验参数。

2. 2. 2 不同超声时间对金花葵多糖提取率的影响 取1.000 g金花葵粉末，以1∶40料液比，固定超声温度60 ℃，分别超声10、20、30、40和50 min后过滤取上清液，浓缩至一定体积，加无水乙醇使乙醇浓度达到80%，静置过夜析出粗多糖，再用无水乙醇洗涤数次，冷冻干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法测定多糖含量，并计算提取率。由图3可看出，超声10～20 min的多糖提取率呈升高趋势，超声时间达20 min后随着超声时间的延长多糖提取率降低，超声30 min与超声10 min时提取率相差不明显，超声30 min后提取率急剧减小，所以选择超声10、20和30 min作为正交优化试验参数。

2. 2. 3 不同超声温度对金花葵多糖提取率的影响 取1.000 g金花葵粉末，以1∶40料液比，分别设超声温度30、40、50、60和70 ℃，超声20 min后过滤取上清液，浓缩至一定体积，加无水乙醇使乙醇浓度达到80%，静置过夜析出粗多糖，再用无水乙醇洗涤数次，冷冻干燥得粗多糖，用水溶解定容至250 mL，按照1.2方法测定多糖含量，并计算提取率。从图4可看出，多糖提取率随着超声温度的升高而增加，但当超声温度达到一定值后多糖提取率随着温度的升高而降低，可能是因为超声温度过高对多糖的结构产生一定的破坏。因此选择超声温度40、50和60 ℃作为正交优化试验参数。

2. 3 正交试验结果

由表2可知，不同因素对金花葵多糖提取率的影响程度不同，通过比较不同因素和水平的平均值和极差，确定各因素对多糖提取率影响大小顺序为B>A>C，即超声时间影响最大，是多糖提取的关键因素；最优试验条件组合为A2B3C2，优化后的最佳提取工艺试验条件为：料液比1∶50，超声时间30 min，超声温度50 ℃。在此优化条件下进行重复性试验（n=3），测得金花葵多糖平均提取率为22.32%，RSD=1.35%。

2. 4 金花葵多糖抗氧化活性的测定结果

2. 4. 1 金花葵多糖对DPPH自由基的清除能力 由图5可看出，金花葵多糖和Vc对DPPH自由基均具有较好的清除效果。在金花葵多糖0.103～3.290 mg/mL范围内，DPPH自由基清除率逐渐升高，在金花葵多糖最大浓度3.290 mg/mL时，DPPH的清除率达75.75%。

2. 4. 2 金花葵多糖对·OH的清除能力 由图6可看出，在金花葵多糖0.685～4.110 mg/mL范围内，随着多糖浓度的增加，其对·OH的清除率也逐步增加，当浓度达到4.110 mg/mL时，清除率达最大值，为73.36%，说明金花葵多糖具有较强的清除·OH能力。

3 讨论

水提醇沉、超声辅助提取方法提取多糖，因具有操作简单、提取率高、能耗低和时间短等优点，已广泛应用于蔗梢多糖提取（何雪梅等，2014）、脆江蘺多糖提取（鞠瑶瑶等，2016）和香菇多糖提取（张敏瑜等，2016）。本研究结果表明，超声时间是影响金花葵多糖提取效果的最主要因素，超声时间过长会破坏其他大分子物质活性（董汝晶，2014），其次是料液比，最后是超声温度。通过正交试验得到金花葵多糖的最佳提取工艺条件为：料液比1∶50、超声时间30 min、超声温度50 ℃，在该工艺条件下重复试验金花葵多糖的平均提取率为22.32%，其RSD为1.35%，说明该方法重复性较好。超声辅助提取不仅操作简单，还省时、环保，适合金花葵多糖的提取。

生命体在新陈代谢中会产生一定的自由基，这些自由基具有很高的活性，会攻击人体细胞和器官等，严重时造成组织损伤引起机体衰老，同时会诱发肿瘤等恶性疾病（邱佳俊，2015）。利用清除DPPH自由基和·OH法来评价抗氧化效果的方法运用较普遍，其中高嘉屿等（2016）采用DPPH法测定白花蛇多糖的抗氧化能力取得了良好的效果。本研究通过体外抗氧化试验发现金花葵多糖对DPPH自由基和·OH有较强的清除能力，与同属的黄秋葵多糖的抗氧化能力（赵焕焕等，2012）相比，金花葵多糖清除DPPH自由基和·OH的能力更强，可作为今后深入研究和开发利用金花葵多糖的参考依据。

4 结论

结合单因素试验和正交试验优化得到的金花葵多糖提取工艺简单、高效可行，提取的金花葵多糖具有较强抗氧化活性，该工艺可在金花葵多糖的提取研究、开发和利用中应用。

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（责任编辑 思利华）