河北坝上草原紫花苜蓿—根瘤菌高效共生体的筛选

陈俊杰 刘晓云 肖猛 鲍雪银 刘忠宽 刘庆辉 郭晓叶

摘要[目的]筛选适合河北坝上寒冷、干旱和半干旱特殊环境下的紫花苜蓿-根瘤菌菌株高效共生体。[方法]采用5株分离自河北坝上地区紫花苜蓿的根瘤菌菌株对敖汉和阿尔冈金紫花苜蓿品种分别进行田间接种试验，测定2种紫花苜蓿品种的平均株高、地上部分干重和结瘤数等性状。[结果]菌株HBU75002和HBU03701在各方面表现较为优良，菌株HBU75002与其他菌株相比，具有显著的增产效果，比对照增产26.6%。接种根瘤菌对2种苜蓿品种生物量也产生了不同影响，敖汉苜蓿产量较阿尔冈金增产幅度略大，最高达36.8%，而阿尔冈金则为35.6%；2株根瘤菌菌株对苜蓿品种也表现出不同的增产效果，菌株HBU03701对阿尔冈金苜蓿的增产效果最佳；菌株HBU75002对敖汉苜蓿的增产效果最佳。 [结论]该研究为苜蓿牧草生产提供高效优良的根瘤菌菌株。

关键词紫花苜蓿；根瘤菌；共生体；田间筛选；干重

中图分类号S541+.1文献标识码A文章编号0517-6611（2017）10-0110-03

Screening the RhizobiaAlfalfa Symbiont in Bashang Region of Hebei

CHEN Junjie， LIU Xiaoyun*，XIAO Meng et al

（College of Life Sciences，Hebei University，Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province， Baoding， Hebei 071002）

Abstract[Objective] To screen the highlyeffective symbiotic strains for alfalfa cultivars in a cold， arid and semiarid environment. [Method] Five rhizobia strains were inoculated two alfalfa cultivars （Aohan and Algonquin） respectively in the field experiments，which located in Bashang region， Hebei Province. [Method] Two nitrogen fixing effective strains （HBU75002 and HBU03701） were found better than others by analyzing total nodule number， plant height and plant dry weight. Comparing with other rhizobia strains， HBU75002 could significantly increased the plant yield， raising 26.6%. Two alfalfa cultivars showed differences in biomass after inoculated with rhizobia strains， the yield of Aohan was better than Algonquin， raising 36.8% for best， and 35.6% for Algonquin. Moreover， the two strains showed different results in improving yield， HBU03701 could significantly improved the yield of Algonquin while HBU75002 for Aohan. [Conclusion] The study provides efficiant and fine strains for producing rhizobial inoculants.

Key wordsAlfalfa；Rhizobia；Symbiont；Field screening；Dry weight

生物固氮是指固氮微生物在常溫常压下将空气中的氮气转化为氨的过程。生物固氮与化学合成氮肥相比具有能耗低、生产过程安全等优势，其中根瘤菌与豆科植物的共生固氮是最强的固氮体系，每年固氮量占全球生物固氮总量的65%以上。高效根瘤菌菌株进行人工接种是增强豆科植物结瘤固氮能力的有效措施。接种根瘤菌不仅能促进苜蓿根系发达，提高产量和品质，而且还能改善土壤结构，提高土壤肥力[1]，促进其他植物生长，并减少化学氮肥使用量，减少对环境的污染，改变中西部地区草地退化的现状[2-4]。

河北张家口坝上草原属温带大陆性季风气候，高寒、干旱、多风、无霜期短、光照充足、昼夜温差大。土壤母质以风沙土为主，表土层薄，极易遭风力、流水的侵蚀，自然植被稀疏。近年来由于过渡放牧和干旱等因素的影响，该地区草地退化严重、草地生产力下降和物种多样性降低[5]。紫花苜蓿（Medicago sativa）是兼具生产和生态功能的饲草之王，素有“牧草之王”之称，不仅含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，同时也是干旱、半干旱地区重要的植物资源。

根瘤菌与豆科植物共生关系的建立是根瘤菌、植物及环境三方面相互作用的结果。无论在植物原产地还是引种地，豆科植物都需要与适应当地环境的根瘤菌种建立共生关系[6]。近几十年来，我国人工接种根瘤菌的效果并不十分理想，其主要原因是未筛选到适合当地气候、土壤环境并与紫花苜蓿有效共生的高效根瘤菌菌株。笔者从河北张家口和山西北部干旱、半干旱地区采集根瘤，并分离、纯化根瘤菌菌株，在河北坝上沽源牧场进行田间接种根瘤菌试验，旨在筛选适合当地土壤环境，并能进行实际生产和应用的高效共生根瘤菌菌株，为苜蓿牧草生产提供高效优良的根瘤菌菌株。

1材料与方法

1.1试验材料

对采自河北张家口和山西大同等地区的苜蓿根瘤进行根瘤菌分离、保存，并进行生理生化、抗逆性以及结瘤能力测试，最终选取5株根瘤菌菌株进行紫花苜蓿田间接种试验，菌株编号及采集地见表1。田间接种试验的供试苜蓿为紫花苜蓿，A品种为阿尔冈金（Algonquin），B品种为敖汉苜蓿（Aohan）。

1.2试验地概况

田间接种试验地为河北张家口市北部坝上沽源牧场，地理坐标为115.8°E，41.8°N。其属于温带干旱、半干旱草原农牧交错地带，土壤pH 7.8～8.2；气候特点是冬季寒冷，最低气温-38 ℃；夏季雨热同季，年降水量300～400 mm，全年蒸发量1 870 mm，70%降水集中在7—9月；全年日照时数达2 200 h，年均日照率66%。

1.3试验方法

1.3.1根瘤菌菌株的培养。

将供试菌株分别接种至克氏瓶YMA培养基上，28 ℃培养2 d；用100 mL无菌水洗涤菌体，装入无菌三角瓶中摇床振荡15 min，分光光度计测定其OD600 nm，计算其含菌量。

1.3.2根瘤菌田间接种试验。

试验设3组处理，分别为紫花苜蓿品种、根瘤菌菌株、不接种。小区面积为4 m2，每个处理重复5次，随机排列，共36个小区，各小区间隔离带宽1 m。2010年7月7日播种，播种前对草地土壤进行轻度翻耙（5～8 cm）并镇压；采用条播方式播种，播种量11.25 kg/hm2，行间距30 cm，播种后覆土2～3 cm，然后进行镇压。

植物生长至70 d左右，可观察到植物开花，当开花植物接近总种植量的50%时，进行第1次刈割，测定植物结瘤数和根长；2011年5月18日对试验小区添加相应根瘤菌菌剂；2011年7月18日对紫花苜蓿进行第2次刈割，对植物株高和地上部分干重（植物样品先在烘箱中105 ℃杀青15 min，后于65 ℃烘干至恒重）进行测定。

1.4数据分析

采用SPSS 16.0软件对试验数据进行单因素和双因素方差分析（Oneway or Twoway ANOVA）；在满足方差齐性的情况下，再利用Duncans检验进行多重比较，确定各因子内部不同水平平均值之间的差异显著性。

2结果与分析

2.1根瘤菌菌株对紫花苜蓿生长性状的影响

方差分析结果表明，菌株之间的结瘤率、株高和干重具有显著差异（P<0.05），而根长在各个菌株之间无显著差异。由表2可知，从结瘤率看，接种5株根瘤菌菌株的植物结瘤率均高于对照组，菌株HBU75002結瘤率为100%，与对照具有显著差异；菌株HBU03701、HBU75035和HBU03725结瘤率也显著高于对照，说明接种根瘤菌对植物结瘤具有显著的促进作用。除菌株HBU75076根长与对照差异显著外，接种其他菌株的苜蓿根长均与对照无显著差异；除菌株HBU03701和HBU75002株高与对照差异显著外，其他菌株与对照均无显著差异。除菌株HBU75002地上部分干重显著高于对照外，其他菌株与对照均无显著差异，菌株HBU75002地上部分干重比对照增加26.6%，菌株HBU03701和HBU75035干重仅次于该菌株。

2.2紫花苜蓿品种对紫花苜蓿干重及与根瘤菌菌株互作的影响

方差分析结果表明，苜蓿品种之间的植物干重具有显著差异（P<0.05），其他性状均无显著差异（P>0.05）。

紫花苜蓿品种与根瘤菌菌株交互影响不显著。由表3可知，阿尔冈金苜蓿接种根瘤菌后，其干重明显高于敖汉苜蓿（除HBU75002外）。在苜蓿品种与根瘤菌菌株之间有一个最优

3讨论

3.1不同根瘤菌菌株对接种植物性状的影响

河北坝上草原属于我国北方重点牧区，土地资源虽然比较丰富，但耕作生产力和生产率低，过度垦殖、破坏自然植被以及土地侵蚀越来越严重[5]。田间试验选择河北坝上沽源牧场作为试验地，是为了获得适宜该地区高效固氮的根瘤菌菌剂，旨在筛选抗寒、抗旱的紫花苜蓿品种和相应的高效固氮根瘤菌菌株。该研究从河北坝上和山西右玉的苜蓿根瘤中分离、纯化根瘤菌菌株，通过抗逆性及结瘤能力测试选择了5株供试菌株进行研究，结果获得了HBU75002和HBU03701 2株较为优良的根瘤菌菌株，明显增加紫花苜蓿的结瘤率和地上部分干重。其他根瘤菌菌株也能与紫花苜蓿形成有效根瘤，促进植物生长，但与菌株HBU75002和HBU03701相比，产量较低，有些菌株产量甚至低于对照，可能与土壤不均一化以及菌株自身的遗传因素有关。

3.2接种根瘤菌对不同苜蓿品种生长的影响

苜蓿作为一种荒漠、干旱、贫瘠地的先锋植物，能很好地适应我国西北地区寒冷、干旱和半干旱的恶劣环境。我国西北部地区荒漠化严重，生态环境又极其脆弱。在退耕还林还草工程中，大面积种植豆科灌木和牧草并接种根瘤菌，可以解决大面积人工林、草场“氮缺乏”等问题，改善生态环境，推动该地区畜牧业的发展。该研究结果表明，接种根瘤菌可以提高植物地上部分干重，与其他学者研究结果一致[7-8]。

苜蓿品种很多，不同品种适合在不同土壤环境下生长，而在土壤氮素相同的条件下，不同苜蓿品种对相同根瘤菌菌株获得的接种效果差异也较大，对一个品种可以产生优异表现的菌株，对另一品种也许只能起诱导反应作用[9-17]。马其东等[18]研究表明，这2种生物之间的交互作用使得根瘤菌与宿主之间需要相匹配，才能使苜蓿获得最佳生长效果。张瑞富等[19]在内蒙古地区比较了多个紫花苜蓿品种，阿尔冈金在株高和产量等方面都优于其他品种。海涛等[20]、曹宏等[21]在哈尔滨进行苜蓿品种比较试验，阿尔冈金产量高于敖汉苜蓿。该研究中，阿尔冈金品种在根瘤结瘤率、地上部分干重方面明显优于敖汉苜蓿。研究表明，不同苜蓿品种适合在特定的土壤环境下生长；同一根瘤菌菌株对不同苜蓿品种产生的接种效果不同[18]。而该研究由于试验样地小区土壤的不均一化，可能导致2种苜蓿结瘤率的差异不显著。

该研究表明，根瘤菌菌株对苜蓿品种具有一定的匹配性，菌株HBU03701较适合于阿尔冈金苜蓿，而菌株HBU75002对于2种苜蓿品种的贡献较为均等。该研究前期通过对这2株根瘤菌菌株在山西补播紫花苜蓿的分子标记研究，发现其竞争结瘤能力较强[22]。该研究进一步说明了其具有较强的结瘤竞争能力。

参考文献

[1] 林國林，马晓明，迟玉成，等.接种根瘤菌对花生生长及其根际土壤微生物数量的影响[J].山东农业科学，2010（6）：63-65.

[2] 刘杰，王赟文，李颖，等.利用土壤筛选紫花苜蓿高效共生根瘤菌的初步研究[J].草业科学，2005，22（2）：21-25.

[3] 曾昭海，隋新华，胡跃高，等.紫花苜蓿-根瘤菌高效共生体筛选及田间作用效果[J].草业学报，2004，13（5）：95-100.

[4] 陈丹明，曾昭海，隋新华，等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的筛选[J].草业科学，2002，19（6）：27-31.

[5] 丁勇，牛建明，杨持.北方草地退化沙化趋势、成因与可持续发展研究：以内蒙古多伦县为例[J].内蒙古大学学报（自然科学版），2006，37（5）：580-586.

[6] 陈文新，汪恩涛，陈文峰.根瘤菌-豆科植物共生多样性与地理环境的关系[J].中国农业科学，2004，37（1）：81-86.

[7] 宁国赞，刘惠琴，马晓彤.豆科根瘤菌及其应用技术[M].郑州：中原农民出版社，1998.

[8] 喻文虎，杨鹏冀，贾德荣.红豆草、紫花苜蓿根瘤菌接种研究[J].草业科学，1995，12（3）：22-25.

[9] PERRET X，STAEHELIN C，BROUGHTON W J.Molecular basis of symbiotic promiscuity[J].Microbiol Mol Biol Rev，2000，64（1）：180-201.

[10] 刘晓云，郭振国，李乔仙，等.南苜蓿高效共生根瘤菌土壤的筛选[J].生态学报，2011，31（14）：4034-4041.

[11] 李友国，周俊初.影响根瘤菌共生固氮效率的主要因素及遗传改造[J].微生物学通报，2002，29（6）：86-89.

[12] BECKER M，DIEKMANN K H，LADHA J K，et al.Effect of NPK on growth and nitrogen fixation of Sesbania rostrala as a green manure for lowland rice（Oryza satiwa L.）[J].Plant and soil，1991，132（1）：149-158.

[13] 王立刚，刘克礼，高聚林，等.大豆对磷素吸收规律的研究[J].大豆科学，2007，26（1）：30-35.

[14] 于景丽，张小平，李登煜，等.celB 基因标记法研究酸性土花生接种及施钼效果[J].植物营养与肥料学报，2006，12（2）：250-253.

[15] 刘莉，周俊初，陈华癸.不同化合态氮浓度对大豆根瘤菌结瘤和固氮作用的影响[J].中国农业科学，1998，31（4）：87-89.

[16] 左元梅，刘永秀，张福锁.NO-3态氮对花生结瘤与固氮作用的影响[J].生态学报，2003，23（4）：758-764.

[17] 程凤娴，曹桂芹，王秀荣，等.华南酸性低磷土壤中大豆根瘤菌高效株系的发现及应用[J].科学通报，2008，53（23）：2903-2910.

[18] 马其东，刘自学，洪绂曾，等.不同根系发育能力的苜蓿品种接种根瘤菌的效果[J].草业科学，1999，8（4）：36-45.

[19] 张瑞富，杨恒山，包宝君，等.8个紫花苜蓿品种多年草产量比较[J].作物杂志，2010（3）：78-81.

[20] 海涛，于辉.不同紫花苜蓿品种产量及品质的比较[J].黑龙江畜牧兽医，2009（5）：65-66.

[21] 曹宏，章会玲，盖琼辉，等.22个紫花苜蓿品种的引种试验和生产性能综合评价[J].草业学报，2011，20（6）：219-229.

[22] 肖猛，刘晓云，刘桂霞，等.BOXPCR分子标记对补播紫花苜蓿共生根瘤菌田间竞争结瘤能力的研究[J].华北农学报，2011，26（1）：187-190.

安徽农业科学2017年