中国新纪录种

扈丽丽 王宏洪 陶冶 林柏荣 卓侃 廖金铃

摘 要 松材线虫是危害松树的重要病原线虫，在调查松材线虫时经常发现其他种类的伞滑刃线虫，明确中国的伞滑刃线虫种类有助于松材线虫的准确鉴定。2015年在广东省的黑松（Pinus thunbergii）上分离到的一种伞滑刃线虫属线虫，除体长比东京伞滑刃线虫（Bursaphelenchus tokyoensis）短及交合伞形状不同外，其余形态特征和测量值基本与东京伞滑刃线虫一致。此外，rDNA-ITS序列与东京伞滑刃线虫的rDNA-ITS序列一致性高达98.2%，基于rDNA-ITS序列的贝叶斯系统发育树表明，该线虫与东京伞滑刃线虫以100%的置信度聚在一起，且遗传距离小。形态学和分子生物学结果确定该线虫为东京伞滑刃线虫。东京伞滑刃线虫是中国新纪录种，黑松是该线虫的新寄主，同时该线虫也是继原始报道后的再次发现。

关键词 东京伞滑刃线虫；黑松；中国；新纪录

中图分类号 Q959.17；S432.4+5 文献标识码 A

Abstract Bursaphelenchus xylophilus causes serious damage to pines， other Bursaphelenchus species are often found with B. xylophilus in pines. Knowing Bursaphelenchus species of our country can help accurate identification of B. xylophilus. In 2015， one Bursaphelenchus species was isolated from Pinus thunbergii in Guangdong Province， China. Morphological and morphometric data were obtained using light microscopy. The Bursaphelenchus population is generally similar with B. tokyoensis from Japan in most morphometric and morphological characters except for smaller body and different bursa shape. Additionally， rDNA-ITS region of the species was amplified and sequenced， showing 98.2% identity to that of the original Japan population of B. tokyoensis. Bayesian inference method was employed to construct the phylogenetic relationship of the Bursaphelenchus population from China and other related Bursaphelenchus species. Sequences from the two populations of B. tokyoensis formed a high supported clade. Therefore， both morphological characters and molecular analyses show the Bursaphelenchus species found in China is B. tokyoensis. B. tokyoensis is a new record in China and P. thunbergii is a new host record of the nematode. Moreover， it is first record after its original description.

Key words Bursaphelenchus tokyoensis； Pinus thunbergii； China； new record

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.021

傘滑刃线虫属（Bursaphelenchus）有100多个种，其中松材线虫（B. xylophilus）和椰子红环腐线虫（B. cocophilus）是国际公认的重要检疫对象[1]。松材线虫是危害松树的重要病原线虫，引起松树的萎焉病，该线虫于1983年在中国南京地区发现[2]。为了阻止松材线虫病的扩散和蔓延，开展了大量松材线虫的调查和检测工作。在调查过程中，发现了许多其他种类的伞滑刃线虫，目前在中国已经发现了约15种伞滑刃线虫[3-8]。随着伞滑刃线虫种类的增多，人们发现有些种类在形态上十分相似，甚至有的种与松材线虫也不容易区分，仅依据形态特征来鉴定包括松材线虫在内的伞滑刃线虫难度越来越大。因此，越来越多的学者在形态学基础上结合分子生物学技术来鉴定伞滑刃线虫，比如超过50个种的伞滑刃线虫已经建立了rDNA-ITS-RFLP图谱[8]。

2015年，本研究从广东省珠海市的黑松上分离到一种伞滑刃线虫，结合形态学和分子生物学技术对该线虫进行鉴定，结果表明，该线虫为东京伞滑刃线虫（B. tokyoensis）。东京伞滑刃线虫是2009年在日本报道的一个新种[9]，该线虫是继原始报道后的再次发现。本文描述的东京伞滑刃线虫为中国新纪录种，丰富了中国的伞滑刃线虫种类，也为中国伞滑刃线虫属线虫的鉴定提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 线虫的分离和形态观察

将树木样品劈成长1～2 cm、宽1 cm左右的薄片，采用贝曼漏斗法进行线虫分离[10]。将分离到的成熟雌虫和雄虫热杀死后在TAF固定液中进行固定，采用甘油-乙醇法对固定后的线虫进行脱水并制作玻片[10]。在光学显微镜（Nikon ECLIPSE 90i）下观察成熟雌虫和雄虫的形态特征，并采用ACT-U软件对线虫进行测量，其中交合刺的长度沿中弧线进行测量。形态测量值的计算采用De Man公式[8]。

1.2 rDNA-ITS序列扩增

采用微量DNA提取法提取线虫DNA[11]。用引物F194（5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′）[12]和5 368 r（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）[13]对rDNA-ITS区进行扩增，PCR反应体系为：DNA模板5 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.125 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，加无菌水至25 μL。扩增程序为：94 ℃ 3 min；接着94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min共35个循环；最后72 ℃ 10 min；扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳检测，每100 mL琼脂糖凝胶加入5 μL EB替代物GoldView。用凝胶图象分析系统照相并保存。

1.3 序列分析

将rDNA-ITS序列的PCR扩增产物。切胶回收，连接到pMD18-T载体，转化克隆后送交上海英骏生物技术有限公司，用3730全自动测序仪测定序列，序列结果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov）上进行同源性检索，序列一致性分析采用DNAStar软件进行[6]。

1.4 分子系统发育树的构建

采用贝叶斯法构建分子系统发育树，构树步骤参照文献[14]。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定结果

通过形态学观察及测量，采自广东珠海黑松上的伞滑刃线虫为东京伞滑刃线虫（Bursaphelenchus tokyoensis Kanzaki，Aikawa & Giblin-Davis）。对该种群描述，其形态测量值及与文献记述的比较见表1。

雄虫（图1-B，F-G，J）：虫体热杀死后呈J形；体环细；侧区具4条侧线；唇区与体部显著缢缩，高1.9～2.2 μm，宽4.6～5.1 μm；口针长11～12 μm，基部略增厚，针锥部占口针全长的40%；中食道球长卵圆形，瓣门位于中食道球中部；排泄孔位于神经环和中食道球中部之间；食道腺从背部覆盖肠，约为中食道球长度的5倍；单精巢，前伸，长度约为体长的30%～50%；交合刺成对，长10.0～15.5 μm，踝突小，方形，难以辨认；喙突小，钝尖或圆；交合刺远端无刺帽；尾短，呈弓形，长度约为肛门处体宽的2倍；尾乳突7个：包括1个小乳突位于泄殖腔前中部；第1对侧腹乳突位于泄殖腔处；其它两对位于泄殖腔后，彼此相邻排列；具1小的端生交合伞，交合伞末端凹陷。

雌虫（图1-A，C-E，H-I）：虫体热杀死后强烈腹弯；体前端及表皮特征与雄虫相似；单卵巢，前伸，长度占体长的30%～45%；阴门具一小的阴门盖；阴道直，向前倾斜；后阴子宫囊长，约为阴门处体宽的7～9倍，占肛阴距的85%～90%；尾短，圆锥形，向末端渐变细，末端具一钉状的突起。

2.2 分子特征

通过DNA扩增、克隆和测序，结果表明东京伞滑刃线虫中国种群rDNA-ITS序列长1 080 bp（GenBank登陆号为KY646465）。将该序列在NCBI上进行Blastn比对，结果表明该序列与东京伞滑刃线虫日本种群的ITS序列（GenBank登录号为AB430445）同源性最高，ITS序列一致性达到98.2%。

为进一步确定该种群的地位，利用MrBayes3.2软件，通过贝叶斯法构建了一棵伞滑刃线虫的rDNA-ITS分子发育树（图2）。从分子发育树发现东京伞滑刃线虫中国种群与日本种群以100%的置信度聚在一支上，且遗传距离小。分子数据进一步确定该线虫为东京伞滑刃线虫。

3 讨论

东京伞滑刃线虫是2009年在日本红松（Pinus densiflora）上发现报道的一个新种[9]，本研究结合形态学和分子生物学技术，在中国广东省珠海的黑松上发现了东京伞滑刃线虫，黑松是其新寄主。这也是继原始报道之后首次发现东京伞滑刃线虫。本研究发现的东京伞滑刃线虫中国种群与已报道的日本种群相比，除了体长较短（雄虫：478.8～624.8 μm vs 632～768 μm；雌虫：520.8～695.6 μm vs 706～871 μm）和交合伞形状不同外，其它形态特征和测量值都基本一致。伞滑刃线虫的交合伞形状存在种内变异的现象，例如梅西伞滑刃线虫（B. masseyi）存在宽圆形或末端凹陷的交合伞[15]，东京伞滑刃线虫日本种群的交合伞与梅西伞滑刃线虫宽圆形交合伞形态相似，而中國种群则与梅西伞滑刃线虫末端凹陷的交合伞形态一致。

植物寄生线虫存在rDNA-ITS序列种内变异[16-18]，在伞滑刃线虫属线虫中，ITS序列种内差异可达到2%[19]。本研究发现的东京伞滑刃线虫中国种群与日本种群ITS序列变异<2%，为1.8%。因此，结合形态学和分子生物学，确定该伞滑刃线虫为东京伞滑刃线虫。

目前，在伞滑刃线虫中，普遍认为只有松材线虫和椰子红环腐线虫是重要的植物病原物，然而拟松材线虫（B. muconatus）中的一些种群对松树也具有致病性[20]。在温室条件下，接种试验表明十二齿小蠹伞滑刃线虫（B. sexdentati）、利昂伞滑刃线虫（B. leoni）、安娜摩伞滑刃线虫（B. anamurius）和瓦里西伞滑刃线虫（B. vallesianus）均会对松树造成危害，特别是十二齿小蠹伞滑刃线虫对松树具有很强的致病性[21-22]。目前，东京伞滑刃线虫日本种群和中国种群都是从枯死的松木上分离获得，到底东京伞滑刃线虫是在松树死亡后进入松树取食真菌，还是可寄生松树使松树死亡有待进一步研究。

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