响应面法优化蓝藻溶藻菌CZBC1发酵培养工艺
2017-05-30胡晓娟徐创文李卓佳文国棵杨铿许云娜李莎莎曹煜成
胡晓娟 徐创文 李卓佳 文国棵 杨铿 许云娜 李莎莎 曹煜成
摘要：[目的]優化蓝藻溶藻菌——蜡样芽孢杆菌CZBC1的发酵培养工艺，为蓝藻溶藻菌制剂的工业化发酵生产提供技术支持。[方法]通过单因素试验筛选适合蜡样芽孢杆菌CZBC1生长的最适碳源和氮源，在单因素试验的基础上，采用中心组合试验设计（CCD）确定关键因子的最佳数量水平，并以Desig-Expert8.0.5进行回归分析，通过响应面分析获得CZBC1的最佳发酵培养工艺参数。[结果]蜡样芽孢杆菌CZBC1的最佳碳源、氮源分别为麸皮+糖蜜（1：1）和酵母膏。以麸皮+糖蜜用量（A）、酵母膏用量（B）、pH（C）、培养时间（D）为因素变量，CZBC1芽孢数（1gN）为响应值，拟合得到二次多元回归方程为1gN=8.5019-0.2222A+0.0998B-0.1292C+0.3801D+0.2194AB-0.1133AC+0.1350AD+0.2049BC-0.0651BD+0.0638CD-0.1260A2-0.3152B2-0.0380C2-0.2533D2，其中，碳源（麸皮+糖蜜）用量与氮源（酵母膏）用量的交互作用、碳源用量与pH的交互作用、碳源用量与培养时间的交互作用、氮源用量与pH的交互作用对CZBCl芽孢数的影响均达极显著水平（P<0.01，下同）。响应面分析优化得到的蜡样芽孢杆菌CZBC1最佳发酵培养参数：麸皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，培养时间42h。此条件下，CZBC1芽孢数的实际值为5.75×108CFU/mL，与理论值（5.90×108CFU/mL）间无显著差异（P>0.05），但极显著高于优化前采用营养肉汤发酵培养的芽孢数（1.28×107CFU/mL）。[结论]采用响应面法优化得出蜡样芽孢杆菌CZBC1最佳发酵培养工艺能有效提高菌株的芽孢数量，且模型拟合效果较好，可用于指导蓝藻溶藻菌制剂的工业化发酵生产。
关键词：蓝藻；溶藻菌；芽孢；培养参数；响应面分析
中图分类号：S917.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2092-08
0引言
[研究意义]养殖水体富营养化日益加剧，蓝藻水华频繁暴发对水体生态环境和养殖效益造成巨大影响（Caoet a1.，2014），如何有效防控有害蓝藻暴发已成为当前水产养殖业的研究热点之一（李茂兵等，2016）。目前，生产上主要使用化学药品防控有害藻类，但其杀藻专一性差，不利于养殖水体优良菌藻环境的养护，且易造成药物残留，影响水产品质量安全（郗建云等，2016）。溶藻菌（Algae-lvsingbacteria）可通过直接接触或释放某些特异或非特异性的胞外物质溶解藻类细胞，还能通过竞争氮磷营养盐来抑制微藻生长，从而达到控藻的效果（陈庆丽等，2015）。可见，溶藻菌制剂的研发及推广应用为有效防控养殖水体有害蓝藻暴发提供了新思路。[前人研究进展]黏细菌（Myxcobacteria）是最早被报道的溶藻菌（吴刚等，2002），其与蓝藻接触后能导致蓝藻的营养细胞溶解，但对静息孢子不产生影响。间接溶藻是溶藻菌作用的主要方式，通过释放特异性或非特异性的胞外物质，如蛋白质、羟胺、抗生素、多肽等杀死藻类细胞，常见的溶藻菌有弧菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌和交替假单胞菌等（王丽花等，2012）。黄姿等（2008）从海南洋浦港沉积物中分离出一株具有较强溶藻活性的细菌，经形态和生理测试及16SrDNA序列分析，初步鉴定为交替假单胞菌（Pseudoalteromonassp.）。颜小丹（2011）从湛江市海滨公园土样中筛选分离出一株溶藻菌，初步鉴定为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacilluslaterosporus），该溶藻菌在黑暗条件下对颤藻（Oscillatoriaplanctoni-ca）和席藻（Phormidumlucidum）的生长抑制效果最佳。曹煜成等（2014）筛选获得一株养殖池塘蓝藻溶藻菌——蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）CZBC1，并证实该菌株具有广温、广盐、耐高pH和低耗氧的特性，可通过直接或间接的方式溶解浮游颤藻、绿色颤藻（O.chlorine）和小颤藻（O.tenuis）等有害蓝藻（王丽花等，2012；王善龙等，2016），但对养殖对虾无不良影响。溶藻菌相对浓度是影响溶藻效果的关键因素，其浓度越高，溶藻效果越明显（张俊等，2010；Yangeta1.，2013）。此外，发酵培养工艺决定了菌剂产品的菌体浓度及品质（BehelandJackson，2014）。唐艳斌等（2013）、Mazzucotelli等（2016）利用响应面分析法分别对枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）的培养工艺进行优化，均有效提高了菌剂产量。[本研究切入点]至今，有关蓝藻溶藻菌的研究主要集中于菌株分离筛选及其溶藻作用机理（Tianeta1.，2012；Jiangeta1.，2014），而鲜见利用响应面分析法优化蓝藻溶藻菌发酵培养工艺的相关报道。[拟解决的关键问题]采用响应面分析法对蓝藻溶藻菌——蜡样芽孢杆菌CZBC1的发酵培养工艺进行优化，以期提高菌体有效菌浓度，为蓝藻溶藻菌制剂的工业化发酵生产提供技术支持。
1材料与方法
1.1试验材料
蜡样芽孢杆菌CZBCl由中国水产科学研究院南海水产研究所对虾健康养殖实验室分离提供，该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏（保藏编号为CCTCCNo：M2013130），并获国家发明专利授权（曹煜成等，2014）。营养肉汤培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，NaCl5.0g/L，pH7.0-7.5。发酵基础培养基：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨3.0g/L，NaCl1.0g/L，KH2PO40.2g/L，MgSO40.2g/L，FeCl30.1g/L，3.08%MnSO41.0mL/L，CaCO30.1g/L，pH7.5-8.0。
1.2试验方法
1.2.1单因素试验 保藏的蜡样芽孢杆菌CZBCl以营养肉汤培养基活化，在发酵基础培养基基础上，选取不同的碳源[葡萄糖、蔗糖、葡萄糖+蔗糖（1：1）、可溶性淀粉、糖蜜、玉米浆、玉米淀粉、麸皮、麸皮+糖蜜（1：1）、可溶性淀粉+玉米浆（1：1）]和氮源[蛋白胨、酵母膏、蛋白胨+酵母膏（1：1）、硫酸铵、豆粕、大豆蛋白、豆粕+大豆蛋白+酵母膏（1：1：1）]，其他成分不变，初始接种浓度×104CFU/mL，30℃下摇床振荡（200r/min）培养，分别于发酵培养24和48h后检测芽孢数。
1.2.2中心组合试验设计（Centralcompositede-sign，CCD） 在单因素试验的基础上，选择4个条件（碳源用量、氮源用量、pH和培养时间）作为因素，每个因素
1.2.3响应面分析 以芽孢数（1gN）为响应值，对CCD试验结果进行多元回归分析，拟合回归方程；并根据回归方程，利用Design-Expert8.0.5绘制响应面分析图进行响应面分析。
1.2.4响应面验证试验 对响应面分析优化确定的培养基组成、发酵条件及预测芽孢数进行摇瓶验证试验，检验回归方程的有效性。
1.3统计分析
采用Design-Expert8.0.5对CCD试验结果进行多元回归分析和响应面分析，并以SPSS19.0检验不同碳源和氮源对CZBCl芽孢数影响的差异显著性。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1不同碳源对蜡样芽孢杆菌CZBCl芽孢数的影响 在基础发酵培养基的基础上，以不同碳源代替基础发酵培养基中的葡萄糖，其他成分不变，发酵培养后所得的芽孢数存在明显差异（图1）。以麸皮+糖蜜作为碳源，在发酵培养24和48h后的芽孢数可达3.58×108和2.93×108CFU/mL，显著高于其他处理组（P<0.05，下同）；采用营养肉汤发酵培养24和48h后的芽孢数仅为5.58×106和1.28×107CFU/mL。因此，选取麸皮+糖蜜作为CZBC1发酵培养基的碳源。
2.1.2不同氮源对蜡样芽孢杆菌CZBCl芽孢数的影响 在基础发酵培养基的基础上，以不同氮源代替基础发酵培养基中的蛋白胨，其他成分不变，发酵培养后所得的芽孢数也存在一定差异（图2）。以酵母膏作为氮源，在发酵培养24和48h后的芽孢数可达3.60×108和1.72×108CFU/mL，尤其是发酵培养24h的芽孢数显著高于其他处理组。因此，选取酵母膏作为CZBC1发酵培养基的氮源。
2.2响应面法优化结果
2.2.1CCD试验结果 通过CCD设计的麸皮+糖蜜用量、酵母膏用量、pH和培养时间4因素5水平试验，得到30组发酵培养蜡样芽孢杆菌CZBCl的芽孢数据，其中芽孢数（1gN）最高值为8.60、最低为6.01（表2）。
2.2.2二次回归拟合及方差分析结果 以芽孢数（1gN）为响应值，利用Design-Expert8.0.5对表2进行多元回归分析，得到二次回归方程：
由表3可知，回归系数模型P<0.0001，说明二次回归模型显著；失拟性的P=-0.0666，说明该模型失拟不显著（P>0.05，下同）；相关系数R2=0.9777，说明二次回归模型能较好地反映响应值变化，即模型与实际试验拟合程度较好，预测值与实际值问具有较高的相关性，可用于蜡样芽孢杆菌CZBCl发酵培养的理论预测。
由表3还可看出，碳源（麸皮+糖蜜）用量、氮源（酵母膏）用量、培养时间的一次项和二次项、pH的一次项、碳源用量与氮源用量的交互作用、碳源用量与pH的交互作用、碳源用量与培养时间的交互作用、氮源用量与pH的交互作用对蜡样芽孢杆菌CZBCl芽孢数的影响均达极显著水平（P<0.01，下同）。各因素对蜡样芽孢杆菌CZBCl芽孢数的影响顺序为：D>B2>D2>A>AB>BC>A2>C>AD>B>AC。
2.2.3各因素间的交互作用 在响应曲面图中，曲面开口向下表示响应值存在极大值，曲面开口向上则表示响应值存在极小值；在等高线图中，等高线呈圆形表示因素问的交互作用对响应值影响不显著，等高线呈椭圆形则表示因素问的交互作用对响应值影响显著（韩建军等，2015；吴存兵等，2016；BhattacharieeandJoshi，2016）。图3反映麸皮+糖蜜用量与酵母膏用量对CZBC1芽孢的影响，其响应曲面图曲线陡、等高线呈椭圆形，即麸皮+糖蜜用量与酵母膏用量的交互效应显著。图4反映麸皮+糖蜜用量与pH对CZBC1芽孢数的影响，其响应曲面图曲线陡、等高线呈椭圆形，即麸皮+糖蜜用量与酵母膏用量的交互效应显著。图5反映麸皮+糖蜜用量与培养时间对CZBC1芽孢数的影响，其响应曲面图曲线陡、等高线呈椭圆形，即麸皮+糖蜜用量与培养时间的交互效应显著。图6反映酵母膏用量与pH对CZBC1芽孢数的影响，其响应曲面图曲线陡、等高线呈椭圆形，即酵母膏用量与pH的交互效应显著。
2.3响应面优化验证试验结果
经DesignExpert8.0.5分析得出蜡样芽孢杆菌CZBCl的最佳发酵培养参数为：麸皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，发酵培养时间42h。在此条件下，CZBCl的理论芽孢数为5.90×108CFU/mL。发酵培养验证试验结果显示，在最佳发酵培养条件下培养菌株CZBC1，其芽孢数实际值为5.75×108CFU/mL，与理论值问无显著差异，但极显著高于优化前采用营养肉汤发酵培养的芽孢数（1.28×107CFU/mL）。表明拟合得到的二次回归方程模型预测准确，可用于指导蓝藻溶藻菌CZBC1的發酵生产。
3讨论
从目前已报道的溶藻菌种类来看，芽孢杆菌（Bacillussp.）为常见的溶藻菌之一。彭超等（2003）从武汉市某养殖池塘分离获得3株能溶解蓝藻的溶藻菌，经鉴定其中1株属于芽孢杆菌属。Li等（2015）分离获得可溶解铜绿微囊藻（Microcystisaerugino-sa）的菌株Lzh-5也隶属于芽孢杆菌属，且证实其浓度与微藻活性呈正相关。芽孢杆菌可产生耐高温的芽孢，既容易存活和繁殖，又适用于生产和剂型加工（王星云等，2007）。因此，在芽孢杆菌的多级发酵过程中，应重点关注芽孢的数量，并通过优化发酵培养工艺、有效提高菌株浓度以保证溶藻效果。
碳源既能为微生物的生长提供原材料，又能为其提供生长所需的能量，是微生物必需的基础营养物质；氮源能为微生物合成蛋白质、核酸及其他氮素化合物提供原材料（赵能等，2016）。微生物间通常存在种属特异性，因不同种菌株生长代谢所产生的酶种类及活性不同，造成其对碳、氮的吸收利用也存在一定选择性（宋瑛瑛等，2016）。因此，筛选适合芽孢杆菌生长的最佳碳、氮源可有效提高其芽孢产量。目前，常用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉等速效碳源，常用的氮源主要有酵母膏和蛋白胨等有机氮源。本研究通过单因素试验对蜡样芽孢杆菌CZBC1生长过程中的碳源和氮源进行筛选优化，结果表明，CZBC1对有机碳源麸皮+糖蜜及有机氮源酵母膏有很好的利用效果，发酵培养24h后其芽孢数分别达5.58×108和4.70×108CFU/mL。碳源麸皮和糖蜜均为饲料级廉价易得的天然有机物，其中麸皮是小麦加工副产物，糖蜜是甘蔗加工副产物。相对于葡萄糖和蔗糖等速效碳源而言，麸皮和糖蜜的成分较复杂，不仅含有丰富的碳源，还含有较多的营养因子和无机元素，是工业化发酵生产中常用的碳源（曹香林和陈建军，2014；何海燕，2016）。氮源酵母膏是由新鲜酵母乳液经酶解、分离、浓缩得到的纯天然制品，不仅能促进细胞生长，还有利于细胞生成代谢产物（许翠等，2015）。
pH是影响芽孢产量的又一重要因素。一方面，pH变化会影响细胞膜电荷，影响营养物质和代谢产物的解离，进而影响微生物对营养物质的利用效果（陈令等，2014）；另一方面，pH变化可对芽孢活性产生影响（刘枫等，2013）。培养时间则是影响芽孢生产率的关键因素。为此，本研究对碳源、氮源、pH和培养时间4个因素的参数值进行响应面优化分析，最终确定CZBCl的最佳培养参数为：麸皮+糖蜜6.84g/L，酵母膏3.36g/L，pH6.50，培养时间42h。在最佳发酵培养条件下，CZBCl的芽孢数实际值为5.75×108CFU/mL，極显著高于优化前采用营养肉汤发酵培养的芽孢数（1.28×107CFU/mL）。说明响应面法优化得出蜡样芽孢杆菌CZBC1最佳发酵培养工艺能有效提高菌株的芽孢数量，可为工业化生产蓝藻溶藻菌制剂提供技术支持。
4结论
采用响应面法优化得出蜡样芽孢杆菌CZBC1最佳发酵培养工艺能有效提高菌株的芽孢数量，且模型拟合效果较好，可用于指导蓝藻溶藻菌制剂的工业化发酵生产。
（责任编辑兰宗宝）
