水杨酸浸种对NaCl胁迫下黍稷种子萌发时α—淀粉酶活性的影响

张美玲　刘克锋

摘要：以黍稷为试验材料，研究在不同的浸种温度、浸种时间、水杨酸浓度对α-淀粉酶活性影响的基础上，利用响应面分析法优化设计处理试验所得数据，以确定黍稷萌发时α-淀粉酶活性最高时的参数。试验结果表明，最优的参数温度为31.3 ℃、时间为18.44 h、水杨酸浓度为0.461 9 mmol/L，在这样的优化条件下，α-淀粉酶活性的理论值为0.461 9，与理论值的贴近度达97.79%。

关键词：黍稷；水杨酸；浸种；NaCl胁迫；α-淀粉酶活性；响应面分析

中图分类号： S516.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0149-04

收稿日期：2014-11-01

基金项目：国家自然科学基金（编号：31100509）；北京市教育委员会科技计划面上项目 （编号：KM201210020005）；国家现代农业科技城成果惠民科技示范工程（编号：Z121100007412003）。

作者简介：张美玲（1988—），女，山西大同人，硕士研究生，研究方向为园林植物栽培生理与生态。E-mail：1004990855@qq.com。

通信作者：刘克锋，硕士，研究员，主要从事土壤肥料及花卉栽培、引种选育、工厂化标准育苗方面的研究。E-mail：liukefeng006@163.com。盐胁迫是指植物生长在浓度比较高的盐土壤中，由于高浓度的盐对其有很大的影响而生长不良。人类赖以生存的这片大地一直受到土壤高含盐量的困扰，中国高含盐量土壤主要分布在黑龙江、河北、山西、西北等一些地区，近年来，设施大棚生产较多，同时设施内土壤含盐量也在逐渐增加，产量逐年下降，大田种植中这种情况发生也很普遍，土壤盐渍化已成为农业生产的主要阻碍因素之一。通过采取相应的化学技术措施可以有效减少盐胁迫对植物的危害，增强作物在高盐度情况下也能良好生长，使得作物的收获量稳定增加，而且每年总收获量能呈现出上升趋势。水杨酸（SA）是植物体内产生的一种简单酚类化合物，即邻羟基苯甲酸，广泛存在于高等植物中[1]。水杨酸浸种能够减弱高盐含量对黍稷的危害，使其对盐胁迫的适应性提高。黍稷是中国常见的种植农作物之一，在经历了很长的农业种植历史后，形成了品种种类繁多的种质资源。黍稷属于禾本科（Gramineae）黍属一年生草本植物。本试验在NaCl胁迫下，研究不同水杨酸浓度浸种对黍稷种子萌发时α-淀粉酶活性的影响，筛选合适的水杨酸浓度、浸种温度、浸种时间，为在高盐条件下黍稷的抗盐栽培提供技术依据。1材料与方法

1.1材料与试剂

供试种子为黍稷原平农20；试剂：柠檬酸缓冲液、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、高锰酸钾、麦芽糖标准溶液[2]、淀粉溶液、四水硝酸钙、硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、铁盐溶液（乙二胺四乙酸二钠和七水硫酸亚铁）、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜[3]、氯化钴。

1.2仪器与设备

722型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），Anke TDL-40B离心机，电热恒温干燥箱，恒温水浴箱。

1.3试验方法

1.3.1浸种温度、浸种时间、水杨酸浓度确定水杨酸浓度为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L 5个浓度；试验温度为10、20、30、40、50 ℃；时间为10、14、18、22、26 h。

1.3.2α-淀粉酶活性的测定

1.3.2.1标准曲线的制作[4]取试管7支，每支刻度为25 mL，各种试剂添加量见表1。试剂混合均匀，在沸腾的水中加热5 min之后，取出冷却，注入蒸馏水定容至20 mL，振动均匀。把1号管定为CK，整到零，D540 nm波长下比色。由此得出麦芽糖的方程为y=0.262 7x-0.016 8，r2=0.986 8，式中：y表示吸光度，x表示麦芽糖含量。麦芽糖标准曲线见图1。

1.3.2.2α-淀粉酶的提取称取0.5 g萌发3～5 d的黍稷种子（芽长1.5～2.0 cm），放在研钵里，加少量的二氧化硅和1 mL蒸馏水，研磨至匀浆。把匀浆倒在50 mL容量瓶中，用蒸馏水将剩余物洗3次倒在容量瓶中，添加蒸馏水定容到50 mL。放在常温下15～20 min以利于充分提取，每隔 1～2 min摇动1次，使其完全提取。之后取少量溶液在3 000 r/min的离心机下，离心10 min，上面清澈的液体就是淀粉酶原液。

1.3.2.3α-淀粉酶活性的测定清洗试管6支，分别标明3支为对照，3支为测定管；每个试管中加入1 mL的酶提取液，在69.5～70.5 ℃下加热15 min，降低β-淀粉酶，拿出每支管后用自来水冷却；各试管中加入0.1 mol/L、pH值5.6的柠檬酸提取液1 mL；对照管加入4 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，以钝化酶的活性。再加入1%淀粉溶液2 mL，混匀；把测定管放于39.5～40.5 ℃恒温水浴中保温15 min后，向其中注入40 ℃下预热的1%淀粉溶液2 mL。振动均匀并立刻放回40 ℃水浴中保温5 min，拿出试管后立即注入0.4 mol/L NaOH 4 mL，然后准备下步糖的测定。

样品测定：吸取上面每个试管中酶反应之后的液体及对照管中的液体分别为2 mL，然后加入到25 mL具塞试管刻度中，再注入DNS试剂2 mL，混合均匀，放到沸腾水中加热15 min，拿出冷却，注入蒸馏水稀释至20 mL，振动均匀后，在D540 nm下对比色，记下吸光度，计算麦芽糖的量，并由以下公式计算酶活性。

结果计算：淀粉酶活性以每克鲜质量所含麦芽糖毫克数表示[mg/（g·min）]。

α-淀粉酶=（A-A′）×Vt/（m×Vs×t ）。

式中：A表示酶水解淀粉变为糖；A′表示淀粉酶CK管里糖含量；Vt表示样品的稀释液总体积；m表示样品的鲜质量（g）；Vs表示显色时所用的酶液体积；t表示酶作用的时间（min）。

1.3.3响应面优化设计响应面优化设计是利用合理的试验设计方法并通过试验得到的数据，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[5-7]。

在不同的水杨酸浓度、浸种温度、浸种时间单因素试验结果的基础上，用Design-Expert.V8.0.6软件[8]对其中重要的3个因素进行响应面分析（表2），进一步优化α-淀粉酶活性的参数。

1.4统计与分析

单因素试验数据的显著性用“x±s”来表示，采用Excel、SAS等软件进行统计分析与制作图表。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1不同浸种温度对黍稷发芽时α-淀粉酶活性的影响设定水杨酸的浓度为1.0 mmol/L，浸种温度为18 h，比较不同的浸种温度（10、20、30、40、50 ℃）在含盐量较高的土壤逆境中对黍稷长芽时α-淀粉酶活性的影响，结果见图2。从图2可以看出，α-淀粉酶的活性受浸种温度的影响，α-淀粉酶的活性随着浸种温度的上升而提高，当温度为30 ℃时，α-淀粉酶的活性最高，随着浸种温度的上升，α-淀粉酶的活性下降。因此，α-淀粉酶活性最高时浸种温度为30 ℃。

分析结果，淀粉酶活性温度为30 ℃显著高于20、10、50 ℃；40 ℃显著高于10、20 ℃；50 ℃显著高于10 ℃，其他处理间差异不显著。

2.1.2不同浸种时间对黍稷α-淀粉酶活性的影响设定水杨酸浓度为1.0 mmol/L，浸种温度为30 ℃，比较不同的浸种时间（10、14、18、22、26 h）在盐逆境条件下对黍稷α-淀粉酶的活力的影响，结果见图3。

从图3可以看出，α-淀粉酶的活性随着浸种时间的延长显示出上升的趋势，试验时间达18 h时为最大值，继续增加反应时间，α-淀粉酶的活性呈下降趋势。因此，浸种时间为18 h时α-淀粉酶活性最高。

多重比较结果：淀粉酶活性浸种18、14 h显著高于22、10、26 h；22 h显著于10、26 h，其他处理之间差异不显著。

2.1.3不同水杨酸浓度对黍稷发芽时α-淀粉酶活性的影响设定浸种温度为30 ℃，浸种时间为18 h，比较不同水杨酸浓度（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L）在盐胁迫下对黍稷种子萌发的α-淀粉酶活性的影响，结果见图4。

增加也渐渐增大，当浓度达到0.5 mmol/L时，活性最大。因此，水杨酸浓度为0.5 mmol/L α-淀粉酶活性最高。

多重比较结果，淀粉酶活性当水杨酸浓度为0.5 mmol/L显著高于 0.25、1.00、1.25 mmol/L，其他处理间差异不显著。

2.2响应面优化

2.2.1响应面优化设计结果综合单因素的试验结果，选择对α-淀粉酶的活性产生影响较大的水杨酸浓度、浸种温度、浸种时间，进行响应面试验设计并应用软件Design-Expert 8.0.6来分析处理数据，结果见表3。

因素 X1（浸种温度）、X3（水杨酸浓度）对α-淀粉酶活性的影响的线性效应 P <0.01，是极显著，而X2（浸种时间）是显著，X1X2、X2X3对α-淀粉酶活性的交互影响是显著，而 X1X3不显著，但X12、X22、 X32的曲面效应都极显著，说明各个因素与响应值之间没有表现出简单的线性关系，可由单因素F值的大小判断各因素对α-淀粉酶活性的作用次序，由此得出强弱的次序为浸种温度>水杨酸浓度>浸种时间。

2.2.2不同处理间的多重比较从表4可以看出：在建立的数学回归模型中，在α=0.05水平上，X1与X2 、X2 与 X3 交互作用显著，而 X1与X3交互作用不显著，依据数据，作出X1X2和X2 X3的等高线图和三维空间响应面图[9]，据此可分析和评价双因素交互作用的影响（图5、图6）。水杨酸浓度一定时，时间与温度的交互作用显著，当水杨酸浓度在零水平时，即0.5 mmol/L 时，随着时间与温度的增加，α-淀粉酶活性显著增大，随后呈下降趋势，坡度较缓；当温度在零水平上时，即为30 ℃ 时，水杨酸浓度与时间的交互作用表现显著，响应值随着水杨酸浓度与时间变大而渐渐升高，当为最大值之后，α-淀粉酶活性反而跟着处理的增高而降低，经软件分析α-淀粉酶活性的最佳件：温度31.3 ℃，时间18.44 h，水杨酸浓度0.472 5 mmol/L，在此条件下，α-淀粉酶活性的理论值为0.461 876。综合实际操作，α-淀粉酶活性的最佳条件为：温度30 ℃，时间18 h，水杨酸浓度0. 5 mmol/L，与理论值的贴近度达97.79%。

3结论

以黍稷为原料，从不同的温度、时间、水杨酸浓度3个方

面考虑α-淀粉酶活性。由回归模型方差比较结果，浸种温度、浸种时间和水杨酸浓度对α-淀粉酶活性的影响的强弱顺序依次为浸种温度>水杨酸浓度>浸种时间。根据单因素试验结果，对参数采用响应面试验的方法处理数字，即黍稷种子萌发时α-淀粉酶活性在水杨酸浓度为0.472 5 mmol/L、温度为31.3 ℃、时间为18.44 h的试验条件下，α-淀粉酶活性为0.461 9，与理论值的贴近度为97.79%。

参考文献：

[1]张逸帆，祝咪娜. 浅谈水杨酸的植物生理作用[J]. 中国新技术新产品，2009（1）：8.

[2]崔婧. 水杨酸与植物抗逆性[J]. 安徽农学通报，2007，13（9）：35-38.

[3]马宗琪，邱念伟. 植物营养液的配制与应用[J]. 生物学教学，2012，37（2）：57-58.

[4]高俊凤.植物生理学实验指导[M]. 北京：高等教育出版社，2006：26-33.

[5]王摇琳，赵荷娟，魏启舜，等. 双孢蘑菇子实体多糖的响应面法优化提取及其纯化[J]. 江苏农业学报，2014，30（5）：1139-1146.

[6]孔涛，范杰平，胡小芳，等. 响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸[J]. 食品科学，2011，32（6）：80-84.

[7]朱兴一，彭章芯，谢捷，等. 响应面法优化口一环糊精辅助提取茶多酚的工艺[J]. 江苏农业科学，2013，41（9）：221-223.

[8]许莺，杨星钢，乔俊亭，等. 星点设计-效应面法优化尼美舒利双层渗透泵片处方[J]. 沈阳药科大学学报，2010，27（11）：857-861.

[9]吴伟，崔光华.星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用[J]. 国外医学：药学分册，2000，27（5）：292-298.杨燕平，宋珂，孙奇，等. 干旱和光照互作对燕麦幼苗生长及生理指标的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（11

：153-155.