甘蔗白叶病研究概况

魏春燕　韦金菊　张保青　宋修鹏　李德伟　覃振强　李杨瑞

摘要：甘蔗白叶病（Sugarcane white leaf disease，SCWL）是一种由植原体寄居甘蔗韧皮部筛管引起并对甘蔗生产造成毁灭性破坏的检疫性病害。文章综述了SCWL的病症、致病植原体、传播途径和发病规律等；阐述了几种病原检测方法的应用前景，指出DNA生物传感器将发展成最简便高效且能实现大田实时评价的诊断方法；重点介绍了SCWL几种防控措施的应用情况和防控效果，指出利用传播虫媒体内共生微生物进行基因改造的共生控制方法将成为未来阻断SCWL病源传播研究的新方向。提出加强蔗区间引种、调种时对SCWL的检疫监测工作，并应根据各地气候环境条件采取有效的综合防控措施等建议，以避免SCWL植原体在蔗区间扩散蔓延，确保蔗糖产业的可持续稳定健康发展。

关键词：甘蔗白叶病；诊断方法；防控措施

中图分类号：S432.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2016-07

0引言

甘蔗白叶病（Sugarcanewhiteleafdisease，SCWL）是一种由植原体（Phytoplasma）寄居甘蔗韧皮部筛管引起并对甘蔗生产造成毁灭性破坏的检疫性病害。该病害于1954年首次在泰国北部南邦府被发现（Marcone，2002），1958年我国台湾也报道了该病的发生（Ling，1962）。目前在印度、孟加拉国、斯里兰卡、巴基斯坦、苏丹、老挝、越南和中国等国家均有SCWL发生的报道（Theineta1.，2012；Lieta1.，2013；Wangeta1.，2015）。泰国甘蔗产业每年因白叶病引起的经济损失超过0.3亿美元（Wongkaew，2012，2013），在我国台湾、孟加拉国、缅甸和斯里兰卡等国家和地区也有SCWL造成甘蔗产业巨大经济损失的报道（Leu，1983；KumarasingheandJones，2001；WinandJung，2012；Wongkaew，2012）。近年来，我国从泰国、菲律宾和缅甸等东南亚国家引进的甘蔗品种/材料检疫检测结果发现有较高的SCWL检出率，且在云南省多个县的不同蔗区均检测发现SCWL（卢文洁等，2012；李文凤等，2014）。SCWL在国外引进甘蔗材料的高检出率及我国云南蔗KSCWL的迅速扩展蔓延，说明SCWL对我国甘蔗产业的可持续发展存在灾害威胁，应对该病害的严格防控予以重视。本文根据国内外的研究概况，就SCWL的病症、传播途径和发病规律、病原检测及防控措施等进行综述，以期为我国科学防控甘蔗检疫性病害SCWL提供参考。

1病症及其发生因素

SCWL的典型症状表现为甘蔗成束叶片变白且分蘖丛芽也为全叶白色。该病的病症从种茎发芽开始到最后的成熟期均可根据不同症状表现进行判断。在不同生长时期和生长条件下甘蔗病株的症状会频繁地发生变化，即叶片失绿程度不同导致叶片病症表现淡绿色、淡黄色、黄白色和纯白色等不同颜色。Wu等（1969）对叶片绿色成分的病理学研究发现，白叶病病症表现与叶片叶绿素的生物合成有关。SCWL植原体数量与叶绿素缺失的关系研究表明，甘蔗体内植原体数量与白叶病病症表现程度有关（Nakashimaeta1.，1994）。染病植株的叶片在表现出像花斑一样的杂色后会因某种环境条件的影响而恢复绿色。染病严重的幼嫩植株会出现从根部产生大量分蘖的现象，且分蘖幼株中出现全株变白的植株数量也会逐渐增加，这些植株会因为严重缺绿而在未成茎前便干枯死亡（Wongkaew，2012）。Leu（1983）关于不同季节温度对白叶病影响的研究结果显示，白叶病病症在冬天不表现，但到了温暖的春夏季节会迅速表现出严重的白叶症状。不同地区白叶病发病率的观察及不同品种对白叶病抗性的初步研究结果表明，白叶病症状的不同表现程度主要与土壤肥力及甘蔗品种有关（Ouvanicheta1.，1990）。因此，SCWL的发病严重程度主要受甘蔗品种、种茎质量、温度、土壤类型、土壤肥力情况及植原体在甘蔗体内的数量等综合因素的影响。

2传播途径

SCWL系由植原体侵染引起，由于植原体定殖在甘蔗韧皮部筛管，因此病害很容易通过甘蔗种茎的无性繁殖方式进行传播蔓延。甘蔗生产上染病种茎的使用被认为是白叶病疫情暴发的最主要原因，大部分蔗农忽视对甘蔗种茎质量的控制使得白叶病疫情迅速发展到无法控制的地步。染病的甘蔗种茎在种植后的分蘖初期便会表现出明显的白叶症状。

白叶病的另一条主要传播途径是通过传病载体叶蝉进行传播。目前，研究报道能传播白叶病病原植原体的叶蝉有两种：Matsumuratettixhiriglyphi-cusMatsumura和YamatotettixflavovitatusMatsumura（Hanboonsongeta1.，2006；RattanabuntaandHan-boonsong，2015）。此外，甘蔗植株和长春花（Cathar-anthusroseusL.）的嫁接试验表明，SCWL植原体也可通过嫁接进行传播（WongkaewandFletcher，2004），而通过机械损伤和菟丝子（Cuscutaspp.）喂养的方法不能传播该植原体（SarinduandClark，1993）。在我国台湾和泰国，白叶病自然传播很可能是通过最有效的传播载体M.hiriglyphicus根据其取食嗜好性进行传播，传播率达55%～100%，且其群体数量动态变化与每个月的甘蔗白叶病发病率密切相关（Pisitkuleta1.，1989；Hanboonsongeta1.，2006；Wongkaew，2012）。研究表明，SCWL植原体可经M.hiriglyphicus的卵巢传递，因此叶蝉被认为是植原体的储存库（Hanboonsongeta1.，2002）。最新研究发现，白叶病传播载体叶蝉的繁殖数量与环境温度高度相关，当环境温度为20℃时，叶蝉的产卵周期需要12d，而环境温度达25℃时，叶蝉产卵周期缩短一半，只需6d，且叶蝉数量会成倍增长（RattanabuntaandHanboonsong，2015）。这也是泰国作为一个常年温度变化不大的热带气候国家其甘蔗白叶病長期无法得到有效控制的一个主要原因。此外，尽管其他的叶蝉种类，如Balclutasp.、Bhatiaolivacea、Exi-tianusindicus、Hecalusprasinus和Reciliasp.也能通过巢式PCR结合16s-23SrDNA基因序列测序检测到其体内存在植原体。目前尚无研究报道它们具有传播力。Y.flavovitatus已被证实能够传播SCWL植原体，只是传播效率较低（Wongkaew，2012）。

3致病植原体

电镜观察定殖在甘蔗韧皮部筛管中的植原体超微结构，发现其具有典型的柔膜细胞结构，但缺乏细胞壁，仅由软细胞膜包被。电镜观察发现植原体在甘蔗筛管细胞中存在多种形状，直径为80-900mm。尽管至今为止植原体未能实现体外培养，但分子生物学技术的发展提供了一个可分析鉴定与基因型有关的类似遗传信息的机会。SCWL植原体隶属于原核生物软壁菌门柔膜菌纲，其16S-23SrDNA基因序列与泰国甘蔗草苗病及印度甘蔗草苗病植原体的基因序列相似度达96%-98%。不同地区和不同来源的SCWL植原体16S-23SrDNA的序列多样性分析结果表明其相似度在89%-98%（Raoeta1.，2007，2008），这些基因序列的多样性主要与栽培品种、种植环境及地理位置的差异有关。

4检测技术

4.1基于显微镜观察技术的检测技术

显微镜观察技术已应用于检测感病甘蔗的植原体，包括光学显微镜、荧光显微镜和电镜。光学显微镜下，用迪纳氏染色法处理后可观察到染病甘蔗筛管细胞中有深蓝色细胞，健康甘蔗的筛管细胞中则观察不到颜色（Deeleyeta1.，1979）。荧光显微镜结合DNA特异的荧光染料4，6-二氨基-2-苯茚二酮可快速精确地检测到染病甘蔗组织切片中的植原体在筛管细胞中的定位情况，基于荧光显微技术，染病甘蔗的筛管细胞中可观察到比薄壁细胞核更亮的弥散荧光，健康甘蔗则观察不到。电镜下可观察到植原体细胞出现在染病甘蔗的筛管细胞及其相邻的细胞中，植原体的超微结构特征及由植原体引起宿主细胞的变形情况均可在电镜下观察到（Nakashimaeta1.，1999；WongkaewandFletcher，2004）。根據电镜观察结果，发现植原体因缺乏细胞壁，其形状多变化且不规则，其直径为80-900mm。尽管上述显微技术只能观察植原体不易辨别的形态学特性，但对SC-WL的初步诊断及宿主细胞和寄主问的细胞学观察研究具有重要价值。

4.2基于血清学的检测技术

在十多年前已有研究人员将传统的多克隆抗体血清学方法用于检测SCWL植原体，且抗体效价1：100才能满足间接酶联免疫检测（SarinduandClark，1993）。该方法可有效区分在染病的禾本科植物（sCWL和甘蔗草苗病及禾本科杂草的白叶病）和其他染病双子叶植物（豇豆变叶病和芝麻变叶病）的植原体。但血清学方法具有易发生交叉反应信号及灵敏度低的缺点，因此难以作为理想的诊断方法。最近，单克隆抗体也已经开发应用并极大地提高了SCWL植原体的检测效率，泰国国家基因工程和生物技术中心合作项目开发了一种用于大田检测SC-WL植原体的试剂盒（专利号No.9582），但该试剂盒制作过程复杂及成本高的特点，导致该技术目前尚未得到广泛应用。

4.3基ZJZDNA斑点杂交技术的检测技术

在过去十几年，基于互补DNA的斑点杂交检测方法已应用于SCwL诊断，该方法中使用的DNAN针包括SCWL植原体染色体和染色体外的随机克隆片段及核糖体DNA互补序列（KlinkongandSeemfiller，1993；Nakashimaeta1.，1994）。在过氧化物酶标记基因和地高辛比色基因试验中均表现为染色体外的DNA克隆片段发出的颜色信号最强，而颜色信号最弱的是16S-23SrDNA探针。所有探针均可根据颜色信号强度将甘蔗茎各部分中植原体的数量进行排序。染色体外克隆的DNA探针还可检测SCWL植原体、白叶病传播载体叶蝉中的植原体和其他感染白叶病的禾本科植物（臂型草、百慕大草和毛茛草）中的植原体，以及感染黄萎病的水稻植株中的植原体。DNA斑点杂交技术还可成功检测新砍甘蔗汁液中的植原体（Wongkaeweta1.，1998）。DNA斑点杂交技术应用于SCWL检测诊断已有十多年时间，由于该技术与随后迅速发展的聚合酶链反应（PCR）技术相比，存在有操作复杂且耗时的缺陷，因此DNA斑点杂交技术目前较少使用。

4.4基于聚合酶链反应（PCR）的检测技术

SCWL植原体的诊断技术中，PCR高敏感度和特异性强的特点比DNA斑点杂交技术具有明显的优势。PCR操作简单，耗时少，目标DNA的单拷贝序列可在1h内扩增100万倍。近年来，PCR已广泛应用于SCWL植原体检测（Nakashimaeta1.，1999；Ku-marasingheandJones2001；Wangeta1.，2014；王晓燕等，2016）。SCWL植原体的检测引物包括根据16SrDNA基因序列设计的植原体通用引物和根据16S-23SrDNA基因序列设计的特异引物。通用引物产生的DNA片段大小约1.4kb，且容易出现非特异条带。特异引物组在感染白叶病的甘蔗样品和禾本科植物样品中检测到的植原体基因片段大小约210或810bp，具体视不同的特异引物而定。SCWL的PCR检测通常是用通用引物或特异引物结合目标样品经一轮的PCR便得到检测结果，而对植原体含量低的样品或带病昆虫载体的DNA则用巢式PCR进行检测，即在第一轮PCR的结果片段中再设计引物，以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR才得到检测结果。尽管PCR是一种非常有效的检测技术，但由于该方法要求操作人员熟练掌握该项技术，且相对甘蔗生产的常规检测而言，该技术的花费较高，因此较适用于实验室对SCWL的诊断鉴定。

4.5DNA生物传感器在SCWL检测中的应用

生物传感器是一种把物理化学检测器和生物成分一体化产生可测电信号的分析型系统，通常由3个组分构成：生物敏感元件、转化器或探测元件和信号处理器。该系统能够利用生物分子去特异识别目标物质。生物敏感元件可根据生物材料（酶、抗体、核酸、细胞器和微生物等）进行创造并在分析条件下特异识别目标，产生与浓度相关的信号。生物传感器已广泛应用于各种研究领域和商业监测（食品、医药、代谢和致病性感染等）。在几种生物传感器中，具有简单、快速、低成本并能检测浑浊样品DNA且结合电化学方法的生物传感器被认为是对包括病害诊断在内的几种生物分析的最理想工具。目前，电化学DNA生物传感器技术已应用于SCWL植原体检测。

研究人员使用由Namba等（1993）根据植原体16SrDNA设计的一对21bp已知序列作为互补DNA探针并用壳寡糖修饰的玻璃碳电极作为传导平台进行杂交反应，结果表明，从植原体16SrDNA探针与感染白叶病植株样品单链DNA的杂交反应中获取的当前信号和电容量明显高于与健康甘蔗植株的单链DNA杂交反应（WongkaewandPoosittisak，2008）。随后，一种用SCWL植原体整个染色体单链DNA制作的无标记DNA生物传感器固定在壳聚糖修饰的玻璃碳电极已被发展为与亚甲蓝嵌入剂相结合的白叶病DNA杂交的特定指示系统，SCWL植原体DNA可通过这些检测0.1nm范围的实验操作系统进行定量测定。相应的DNA杂交检测还可通过原子显微镜实现可视化观察（WongkaewandPoosittisak，2014）。这些结果说明DNA生物传感器可用于甘蔗白叶病植原体的检测诊断，并有望在今后使用简便可靠和低成本的设备对大田甘蔗白叶病进行实时监测。

5SCWL的防控措施

根据已有的研究报道，SCWL的防控措施包括：用热水和四环素处理的方法对甘蔗种茎中的植原体进行移除；使用杀虫剂控制主要传播载体叶蝉的大量繁殖；使用甘蔗健康种苗；控制蔗地的环境卫生并及时销毁病株及其残留物；进行非禾本科作物轮作；严格进行SCWL检疫监管及抗病品种培育。

5.1热水和四环素处理

但有研究报道，甘蔗种茎用热水处理已不能有效清除甘蔗种茎中的白叶病植原体。Liu等（1963）、单红丽等（2013）研究结果表明，50℃热水处理甘蔗种茎2-4h或53℃热水处理1h均不能有效杀死种茎中的植原体，而52℃热水处理8h或54℃热水处理40min可達到一定的防治效果，但大部分甘蔗种茎经过高温处理后不能正常发芽。四环素处理对甘蔗种茎中植原体的移除效果比热水处理好。Shigata等（1969）的研究结果表明，用四环素处理染病甘蔗种茎72h可有效减少白叶病植原体在甘蔗中的繁殖，且种茎发芽后3个月内未发现白叶病症状。该研究结果也得到Mongkolsuk和Sutabutra（1976）的进一步证实，他们的研究发现甘蔗种茎在200～500ppm（200-500mg/L）四环素溶液中处理24h后种植，对植原体的防治效果在2周内可体现出来，甘蔗叶片在种植后第4周完全变绿且维持了8周。四环素处理对SCWL植原体的移除效果在甘蔗组培苗繁殖过程中也得到证实。经过200-500ppm（200-500mg/L）四环素溶液处理的带病甘蔗种茎发芽后用于组织培养，结果发现连续5-8次继代培养或至少8个月的连续继代培养得到的组培苗有70%-100%～十片呈现绿色（Wongkaewand Fletcher，2004）。

5.2杀虫剂的使用

通过喷施杀虫剂杀死SCWL的主要传播载体叶蝉的方法来控制白叶病发生曾被认为无效（Wongkaew，2012）。早在1974年，研究人员通过喷施有机磷杀虫剂马拉松来杀死叶蝉以降低白叶病的发生率，但效果不理想（Leu，1974）。在泰国，研究人员还通过使用杀虫剂丁硫克百威喷施超过3.2ha的甘蔗种植区，在白叶病传播载体达到数量高峰期（每年的7-8月）前的4-6月，每2周喷施一次，结果发现SCWL发生率及传播载体叶蝉的数量均未得到有效控制（Wongkaew，1999）。然而，最新的研究发现杀虫剂呋虫胺可有效杀死SCWL主要传播载体Mhi-roglyphicus，且此杀虫剂对甘蔗钻心虫天敌赤眼蜂的杀伤力很小（KoboriandHanboonsong，2017）。

5.3健康种苗的繁育

通过组织培养繁育无病甘蔗苗被认为是控制SCWL植原体在植株上系统定殖的最有效方法。在我国台湾，通过传统选择和组织培养技术的集约式生产方式可成功阻止白叶病的暴发已被证实（Leu，1978）。在泰国，同样也通过茎尖培养生产无病苗的方式大量繁育甘蔗健康种苗，1996-1999年大量推广使用甘蔗无病组培苗及其产生的种茎来控制SCWL的发生传播，并获得很好的成效（WongkaewandFletcher，2004），当地蔗农也被极力劝说使用无病组培苗种茎。

5.4控制蔗地的环境卫生和进行作物轮作

控制蔗地环境卫生主要是为了防止SCWL植原体的再次感染，蔗农应从地里挖除全部染病植株并把残留物全部清除。在我国台湾水分充足的地方，蔗农会用更有效的方法取代作物轮作。据调查，我国台湾春季SCWL的发病率较低，因此蔗农被建议把种植时间从往常的秋季改为春季，由于白叶病主要传播载体M.hiriglyphicus的数量及白叶病植原体的繁殖均在低温的冬季受到限制，因此在春季种植的甘蔗其白叶病植原体感染率下降（PanandYang，1970）；在我国台湾缺水的地区，甘蔗种植被强烈推荐使用绿肥。以上这些措施并结合无病甘蔗组培苗种茎的使用，使SCWL的发生得到有效控制（LeuandKusalwong，2000）。然而，在泰国这个常年温度变化不大的热带国家，采用变换甘蔗种植季节的措施对SCWL的控制作用不明显，最适当的防治措施是保证蔗地环境卫生并结合无病健康种苗的使用及与绿肥经济作物轮作。1989-1991年，在泰国东北部，用木豆和刀豆轮作的同时使用新的甘蔗品种代替抗病性较弱的旧品种成功地控制了SCWL的发生；但1996-1999年由于蔗农逐渐忽视了这种合适的栽培方式，SCWL在该地区又重新暴发且发病率更高（Wongkaew，1999）。尽管通过上述栽培方式在研究项目进行期间可有效减少SCWL造成的经济损失，但不久后由于蔗农忽视这种栽培方式的重要性导致SCWL重新发生，至今SCWL仍是导致泰国甘蔗产业损失的最主要原因。

5.5加强检疫监测

甘蔗被检疫机构归为禁止入境材料时，引入地的政府检疫部门需对SCWL进行严格监察，防止外来引进蔗种引起当地SCWL的发生和传播。这种检疫监测措施在我国台湾的实行已成功控制SCWL发生（Leu，1983）。在泰国，由于对甘蔗种茎进行常规检疫监测的措施未得到广泛实行，SCWL发病率及其带来的经济损失仍得不到有效控制。

5.6抗病品种培育

尽管抗病品种的使用是控制病害发生最理想的措施，但至今尚未发现抗SCWL品种。Leu（1974）通过利用虫传方法对至少400个甘蔗品种包括野生甘蔗品种SaccharumspontaneumL_进行检测筛选，结果未发现有抗病品种。2004～2007年，泰国研究人员对所有甘蔗品种包括它们的杂交后代及野生甘蔗品种又一次进行接种试验验证，结果仍未发现有抗或耐SCWL品种（Sa-Ngaunrangsirikuleta1.，2007）。随后在各甘蔗研究机构（公司及大学）均有研究人员进行各种抗病品种评价试验，但目前尚未报道发现有抗白叶病的甘蔗品种。

6展望

SCWL是极易通过带病种茎进行远距离传播的一种危害性极强的检疫性病害，其致病植原体主要通过昆虫媒介叶蝉进行传播。SCWL的致病植原体目前尚未能进行体外培养，因此研究人员主要致力于SCWL检测技术和防控措施的研究。SCWL的早期诊断对于及早发现病源并使该病害得到及时有效控制起着关键性作用。在本研究中提到的几种SC-WL诊断技术中，显微镜技术、血清学技术及DNA斑点杂交技术已很少使用，目前使用最广泛且成熟的检测技术是PCR。虽然PCR对于实验室科研人员来说是最普遍常用的一种甘蔗病害检测技术，但对于甘蔗生产的常规检测，该技术花费较高且要求技术人员要熟练掌握该技术的操作。目前SCWL的PCR检测大多使用巢式PCR，即需要经过两轮PCR才能得到最终检测结果（Wanget a1.，2014；王晓燕等，2016）。此外，PCR检测容易出现假阳性的检测结果，巢式PCR由于需要用第一轮PCR产物作为模板进行第二轮PCR，因此其假阳性检出率将会高于常规PCR检测（Borstet a1.，2004）。近年来，結合电化学方法的分子传感装置（DNA生物传感器）的使用成为一种具有高特异性、灵敏度高、快速且成本低的新检测技术（Weiet a1.，2010；Yinet a1.，2012）。研究人员利用电化学伏安法技术结合SCWL-ssDNA探针首次对甘蔗商业种植地样品进行了SCWL实时诊断（WongkaewandPoosittisak，2014），结果表明DNA生物传感器将有望成为一种SCWL实时监测诊断非常方便的工具。研究人员可对该诊断技术的可行性、检测灵敏度的提高和便携式设备的生产等进行更深入研究，以实现田问SCWL快速有效诊断。

尽管目前已有多种防控SCWL的方法，如利用热水和抗生素处理种茎和烧毁染病的植株材料及使用健康种苗等，但均未取得理想的防控效果（KaewmaneeandHanboonsong，2011）。若SCWL的主要传播媒介叶蝉不能被消除，即使在种植完全无病甘蔗种茎的地块也很快会重新感染SCWL。目前已有研究人员找到了比较适合用于控制传播媒介叶蝉繁殖的杀虫剂呋虫胺（KobofiandHanboon-song，2017），但在甘蔗地大范围喷施杀虫剂并不现实，且长期使用化学杀虫剂容易产生杀虫剂抗性及影响环境可持续发展等问题。利用生物防控技术的一种共生控制新方法将有望防治SCWL传播媒介叶蝉，且已有研究人员对该方法用于SCWL的防控进行了初步研究（Wangkeereeet a1.，2012）。共生控制是以传播虫媒体内的共生微生物作为遗传改造对象，在宿主体内表达抗病效应分子来抑制病原体发育以达到阻断病源传播的目的，该方法在控制虫媒传播病害方面具有广阔的应用前景。总而言之，目前尚未发现有任何一种方法可以很好地防控SCWL，因此，蔗区间引种、调种应加强对SCWL的检疫监测，同时根据当地气候环境条件采取有效的综合防控措施，避免SCWL植原体在蔗区间扩散蔓延，确保蔗糖产业的可持续稳定健康发展。

（责任编辑麻小燕）