河南省猪等孢球虫的分子变异规律研究

刘光辉 程俊贞 宁长申

摘要[目的]掌握河南省猪等孢球虫的分子变异规律。[方法]从河南省豫东、豫南、豫西、豫北及豫中地区的部分规模化猪场采集粪便样品，进行猪球虫卵囊的分离与纯化；从分离到的8株猪球虫分离株中提取核酸并进行测序，并与猪等孢球虫扩增株基因序列及其他相关原虫基因序列进行比对。[结果]河南省不同地区的8个猪球虫株均为猪等孢球虫，并且没有明显遗传差异。I.suis与其他7种原虫差异较大，不属于同一个生物型，同一种动物所感染的不同种类原虫之间的同源性较低。[结论]该研究结果可为有效预防和控制仔猪球虫病提供科学依据。

关键词猪等孢球虫；纯化；扩增；基因序列

中图分类号S858.28文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0093-03

Abstract[Objective] To master the molecular variation laws of Isospora suis in Henan Province. [Method] The pig manure samples were collected from some largescale pig farms in eastern， western， southern， northern and central regions of Henan Province to isolate and purify porcine coccidian oocysts. 8 isolated strains of swine coccidiosis were used to extract nucleic acid and sequence. The gene sequence of I. suis were compared with that of other related protozoon. [Result] 8 swine coccidian strains from different regions of Henan Province were identified as I. suis and there was no obvious genetic differences. I. suis had greater differences with other 7 kinds of protozoon. I. suis and other 7 kinds of protozoon belonged to different biotypes. The homology of different kinds of protozoon infected in the same kinds of animals was lower. [Conclusion] The research results can provide scientific basis for effective prevention and control of piglet coccidiosis.

Key wordsIsospora suis；Purification；Amplification；Gene sequence

近年來，哺乳仔猪患球虫病是养猪场的常见问题之一，引起哺乳仔猪患球虫病的主要病原是猪等孢球虫[1-2]，主要发生在8～15日龄仔猪上，感染日龄越小，病情越严重。发病仔猪排出黄色至灰色粪便，开始时粪便松软或呈糊状，随着病情的加重，粪便变成液状，并发出腐败乳汁样酸臭味；吮乳减少，被毛粗乱，脱水，体增重下降，从而导致新生仔猪死亡率增加，断奶时营养不良仔猪成为僵猪，给养猪生产造成了巨大的经济损失[2]。

为掌握河南省猪等孢球虫的分子变异规律，笔者从河南省豫中地区的漯河和许昌，豫南地区的南阳、信阳及驻马店，豫西地区的洛阳，豫北地区的鹤壁，豫东地区的周口等8个市的部分规模猪场进行采样，收集猪等孢球虫卵囊，并进行纯化。利用分子生物学方法对其18S rRNA基因进行PCR扩增，并对PCR扩增片段进行测序，然后利用DNAstar、ClustalX、Paup、Phyplip等软件进行序列比对分析，构建分子基因树，分析河南省不同地区猪等孢球虫分离株的遗传特征，阐明猪等孢球虫病的分子变异规律，旨在为有效预防和控制仔猪球虫病提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂。试验所用试剂有饱和糖-盐水溶液、DNA提取试剂盒等。

1.1.2仪器。试验所用仪器有显微镜、PCR仪等。

1.2方法

1.2.1样品采集。采用直肠取粪法，采集1～30日龄仔猪的粪样或刚排出的新鲜粪便50～100 g，分别装入干净塑料袋中，标注猪场名称、编号以及猪的年龄，置于4 ℃冰箱内，备用。

1.2.2卵囊收集。用饱和糖-盐水溶液漂浮法收集球虫卵囊[3-5]。在阳性粪样中加入4～5倍体积的水搅拌均匀，在装有80目和130目双层金属筛的漏斗中过滤，将滤液置于离心管中以3 000 r/ min的转速离心10 min，取出离心管，弃上清，再加入约50 mL的饱和糖-盐水溶液，用干净的玻璃棒搅拌均匀，再以3 000 r/min的转速离心10 min，然后用专门收集卵囊用的铁丝圈网多次蘸取上层表面液在装有约100 mL自来水的烧杯中涮洗，即将卵囊收集到烧杯中，制成卵囊混悬液；最后，将卵囊混悬液以3 000 r/min的转速离心10 min后取出离心管，弃去上清，即为球虫卵囊。

1.2.3卵囊的纯化。取收集的卵囊液，采用饱和糖水溶液漂浮法和梯度离心法进行纯化。取收集的卵囊液置于10 mL离心管中，以2 000 r/min的转速离心10 min后取出离心管，取上层（卵囊层）和上清液及中间层置于1个烧杯中，之后再加入等量的PBS工作液，混匀，备用。在10 mL离心管中先后加入3 mL饱和糖水溶液（饱和糖水溶液∶自来水=1∶12）、3 mL 1∶2饱和糖水溶液（饱和糖水溶液∶自来水=1∶2）和3 mL上述卵囊液，以2 000 r/min的转速离心10 min，取上面卵囊层和上清液置于1个烧杯中，此后再加入4倍量的PBS工作液，混匀后以4 000 r/min的转速离心10 min，取沉淀即为浓集的卵囊，于-20 ℃下保存，备用。

1.2.4PCR扩增。

1.2.4.1猪等孢球虫DNA的提取。取上述浓集的卵囊，加入约5 mL的PBS液，混匀后用超声波粉碎仪将猪等孢球虫卵囊打碎，以16 000 r/min的转速高速离心30 min，弃上清，取沉淀，在沉淀物中加入200 μL裂解液，振荡数次，混匀。5次反复冻融（液氮中5 min，37 ℃水浴中5 min），然后按照DNA提取试剂盒说明书进行DNA的提取。重溶DNA置于适量的缓冲液（pH 8.0）中，于-20 ℃下保存。

1.2.4.2PCR反应。参照刘光辉等[6]PCR扩增猪等孢球虫18S rRNA基因全序列的方法，PCR反应程序：94 ℃预变性8 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1.5 min，72 ℃ 2 min，共37个循环；最后延伸72 ℃，10 min。将反应液充分混匀，短暂离心后，置于94 ℃预变性8 min，再加入5 U/μL TaKaRa Ex Taq混匀，离心后将反应管置于PCR仪中按照相应程序进行热循环反应，结束后将样品置于4 ℃下保存。

1.2.5序列测定与分析。

1.2.5.1PCR产物测序。PCR产物及测序用引物直接送交宝生物工程（大连）有限公司测序。结合GenBank数据库上登录的相关原虫序列，使用DNAstar 4.0软件比较其同源性，经过ClustalX 1.81软件序列比对，使用Paup 4.0、Treeview 30、Phylip种系发育关系软件进行聚类分析，绘制基因树。

1.2.5.2PCR产物序列及GenBank下载的其他原生动物18S rRNA基因序列。①猪等孢球虫扩增传代株（以下简称KZ株）；②猪等孢球虫漯河地区分离株（以下简称LH株）；③猪等孢球虫许昌地区分离株（以下簡称XC株）；④猪等孢球虫南阳地区分离株（以下简称NY株）；⑤猪等孢球虫信阳地区分离株（以下简称XY株）；⑥猪等孢球虫驻马店地区分离株（以下简称ZMD株）；⑦猪等孢球虫洛阳地区分离株（以下简称LY株）；⑧猪等孢球虫鹤壁地区分离株（以下简称HB株）；⑨猪等孢球虫周口地区分离株（以下简称ZK株）；⑩L76471 I.felis；U97523 I.suis；U94787 I.belli；AF029303 I.ohioensis；M97703 T.gondii；AF080612 I.robini； AF108861 C.pig； L16996 C.parvum。

2结果与分析

2.1卵囊纯化结果经过4～5次纯化，在浓集的球虫卵囊液中仍含少量的微粒杂质，具体纯化效果如图1所示。

2.2不同地区猪等孢球虫分离株18S rRNA基因的 PCR扩增结果对PCR扩增产物进行鉴定，发现LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株都能扩增出特异性DNA带，大小在1 800 bp左右（图2），符合预期的目的条带大小。

2.3测序结果经过PCR扩增后，LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株及KZ株的猪等孢球虫18S rRNA基因的PCR产物由宝生物工程（大连）有限公司进行测序，测序结果如下：①I.suis LH株（测序编号为ZZS340）18S rRNA基因序列，测序长度为1 720 bp；②I.suis XC株（测序编号为ZZS341）18S rRNA基因序列，测序长度为1 721 bp；③I.suis NY株（测序编号为ZZS342）18S rRNA基因序列，测序长度为1 723 bp；④I.suis XY株（测序编号为ZZS343）18S rRNA基因序列，测序长度为1 659 bp；⑤I.suis ZMD株（测序编号为ZZS344）18S rRNA基因序列，测序长度为1 710 bp；⑥I.suis LY株（测序编号为ZZS345）18S rRNA基因序列，测序长度为1 724 bp；⑦I.suis HB株（测序编号为ZZS346）18S rRNA基因序列，测序长度为1 727 bp；⑧I.suis ZK株（测序编号为ZZS347）18S rRNA基因序列，测序长度为1 708 bp；⑨I.suis KZ株（测序编号为ZZS348）18S rRNA基因序列，测序长度为1 725 bp。

2.4序列比对结果试验测定9株猪等孢球虫序列，结合从GenBank下载的其他原生动物18S rRNA基因序列，以L16996（C.parvum）作为外群，用DNAstar 4.0软件比较其同源性，经过ClustalX 1.81序列比对，使用Paup 4.0、Treeview 3.0、Phylip种系发育关系软件分析进行聚类分析，并构建基因树（图3）。从图3可以看出，17种原虫分别处在3个进化枝上。其中，KZ株单独作为第1枝；I.felis、I.suis（下载）、T.gondii、I.robini、C.parvum、C.pig、I.belli、I.ohioensis形成第2枝，而LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株作为第3枝。第3枝，LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株之间差异不显著，同源性较高，为99.7%～100%，形成一个单种系；其中，XC株和XY株、HB株和LY株之间的同源性高达100%。LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株、ZK株和KZ株虽不在同一个进化枝上，但通过同源性比较和差异性分析，第3枝与第1枝的的同源性为98.6%，与I.suis（下载）的同源性为96.3%，说明扩增的18S rRNA基因序列符合预期目的要求，并且LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株、ZK株和KZ株之间没有变异，分离株为猪等孢球虫。此外，I.suis与其他7种原虫之间差异较大，同源性较低，为79.6%～85.2%，说明I.suis与其他7种原虫不属于同一个生物型。

3结论

（1）从分离的8株猪等孢球虫（LH株、XC株、NY株、XY株、ZMD株、LY株、HB株和ZK株）提取DNA后，通过PCR扩增都能扩增出大小约1 800 bp、特异性的目的DNA条带，并测得其18S rRNA基因全序列。

（2）经过ClustalX 1.81序列比对，使用Paup 4.0、Treeview 3.0、Phylip和DNAstar 4.0等分子生物学软件分析，发图3基于18S rRNA基因序列的Isospora suis和相近原虫的的聚类分析结果

Fig.3The clustering results of 18S rRNA gene sequence between Isospora suis and other related protozoon現8株猪等孢球虫18S rRNA基因序列之间的同源性较高，为99.7%～100%，说明河南省猪等孢球虫不同分离株之间不存在基因变异；与GenBank上登录的I.suis 18S rRNA基因序列相比，同源性为96.3%，说明所扩增的18S rRNA基因序列符合预期目的要求。I.suis与其他7种原虫之间差异较大，同源性较低，为79.6%～85.2%，说明I.suis与其他7种原虫不属于同一个生物型，证实同一种动物所感染的不同种类原虫之间的同源性较低。

参考文献

[1] 蓝荣庚.猪等孢球虫病对规模猪场生长育肥猪的生长危害值得关注[J].今日养猪业，2011（4）：13-17.

[2] 高峰，刘建军.猪等孢球虫病的病原、流行与诊治[J].现代畜牧科技，2015（5）：55-56.

[3] 刘光辉，宁长申，张龙现，等.猪等孢球虫纯种卵囊扩增及生物学特性研究[J].河南农业大学学报，2005，39（4）：410-416.

[4] 温福利，岳良平，黄翠琴，等.福建地区部分猪场猪等孢球虫感染情况调查与分析[J].畜牧与兽医，2014，46（4）：69-74.

[5] 黄仪娟.广东猪等孢球虫感染情况调查及其部分生物学特性研究[D].广州：华南农业大学，2016.

[6] 刘光辉，宁长申，张龙现，等.猪等孢球虫PCR诊断方法的建立[J].中国农学通报，2007，23（9）：63-69.