小菜蛾表皮蛋白基因克隆及表达分析

申建梅　陈炳翰　郭晓洁　胡黎明

摘要：【目的】克隆小菜蛾表皮蛋白基因（Plutellaxylostella cuticularprotein，PxyICP），分析其序列特征和发育表达模式，为深入研究PxyICP在小菜蛾表皮形成中的生理功能提供科学参考。【方法】以小菜蛾为试验材料，采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和快速扩增cDNA末端（RACE）技术克术克隆PxyICP，以生物信息学方法对其序列特征进行分析，并采用实时荧光定量PCR研究PxyICP mRNA在小菜蛾不同发育时期中的相对表达量。【结果】克隆获得的PxyICP基因开放阅读框长531 bp，编码177个氨基酸，相对分子质量约18.90 kD，等电点为5.32。氨基酸序列分析结果表明，小菜蛾表皮蛋白第1～16位氨基酸是参与跨膜蛋白转移的信号肽，且该序列具有昆虫表皮蛋白CPR家族中RR-1型保守基序的典型特征。不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明，PxyICP在小菜蛾各发育时期的表达量不同，其中PxylCP在2、3和4龄幼虫、蛹和成虫中的表达量分别是1龄幼虫的2.43、0.51、0.63、3.195和12.32倍，以在成虫的表达量最高。【结论】成功克隆获得PxyICP基因，根据其发育表达模式推测PxyICP蛋白参与小菜蛾成虫表皮的硬化和黑化等生理过程。

关键词：小菜蛾；表皮蛋白；基因克隆；实时荧光定量PCR

中图分类号：S436.341.24 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）12-2176-06

0引言

【研究意义】小菜蛾[Plutella xylostella（Linnae-us）]为鳞翅目菜蛾科昆虫，主要危害十字花科蔬菜，致使十字花科作物的品质和产量大幅降低，甚至绝收。其年发生世代多、繁殖率高、世代重叠现象严重（Furlong et al.，2013）。目前，生产上主要采用化学药剂防治小菜蛾，但由于过度使用化学药剂使得小菜蛾已对有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类等多种杀虫剂产生不同程度的抗药性（冯夏等，2011；Sun et al.，2012；夏耀民等，2013；苏文敏等，2016）。昆虫表皮是昆虫抵御外界不良环境的第一道防线，其在昆虫保持体形和防止体内水分蒸发等生命活动中具有重要作用，昆虫可通过调节表皮渗透能力而产生抗药性（Andersen et al.，1995）。表皮蛋白ICP（Cu-ticular protein）是构成昆虫表皮的主要成分，因此，如果以小菜蛾表皮的重要构建元素——表皮蛋白作为药物防治靶点来设计新型药物，可严重破坏小菜蛾表皮组成、结构的完整性及外骨骼构建等，同时有助于提高药剂对小菜蛾体壁的穿透以提高药剂的毒杀效果，这将有效提高对小菜蛾的防治效果，为小菜蛾防控提供新的策略。【前人研究进展】昆虫表皮蛋白是一种结构蛋白，是构成昆虫体壁的重要组成成分，在昆虫角质层抵御外界不良环境中发挥着不可或缺的作用（Kucharski et al.，2007）。目前，表皮蛋白的保守结构域分别有R&R保守结构域、Tweedl基序、44个氨基酸残基和富含甘氨酸基序等（Guan eta1.，2006；He et al.，2007；Togawa et al.，2007）。刘清明等（2010）、孙汝江（2014）提出昆虫表皮蛋白按照不同的保守模体可分为CPR、CPT、CPF、CPFL和CPG五大家族，其中CPR家族约占五大家族的70%，是数量最多的一种表皮蛋白。现已在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、家蚕（Bombyx mori）和烟草天蛾（Man-duca sexta）等多种昆虫基因组发现CPR家族表皮蛋白（赵小明等，2017）。Rebers和Riddiford最先鑒定出CPR家族的R&R保守基序为：G-x（8）-G-x（6）-Y-x（2）-A-x-E-x-G-F-x（7）-P-x-P（数字代表氨基酸的数目）（刘清明等，2010；孙汝江，2014），R&R保守基序是表皮蛋白和几丁质的结合区域，其对角质层结构起重要作用（唐亮，2010）。在随后的研究中，学者又根据R&R保守基序的差异将CPR家族分为三个亚族：RR-1亚族、RR-2亚族和RR-3亚族（Soares et al.，2007）。昆虫表皮蛋白种类繁多，每一种表皮蛋白的功能可因所处昆虫发育阶段及组织的不同而异（梁九波，2012）。赤拟谷盗RR-1型表皮蛋白TcCPR4和TcCP30对赤拟谷盗表皮形成起着关键作用（Mun et al.，2015；Noh et al.，2015）。黑腹果蝇表皮蛋白基因TweedleD1的缺失导致幼虫和蛹的体形变粗短，表明TweedleD1参与了黑腹果蝇体形的塑造（Guan et al.，2006）。马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）通过上调表皮蛋白基因Ld-GRPl、Ld-GRP2和Ld-GRP3的表达量来增加表皮成分以应对环境压力（Zhang et al.，2008）。昆虫表皮蛋白主要在昆虫表皮整合、体型塑造、骨化部位构建、适应环境等方面发挥重要作用（Dittmer et al.，2012）。【本研究切入点】目前，多种昆虫的表皮蛋白基因已相继被报道（马艳等，2013），但有关小菜蛾表皮蛋白基因序列分析和差异表达的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和快速扩增cDNA末端（RACE）技术扩增小菜蛾表皮蛋白基因（P.xylostella cuticular protein，PxyICP）并进行生物信息学分析，通过荧光定量PCR检测PxyICP基因的发育表达模式，为进一步探讨小菜蛾表皮蛋白的生理功能提供科学参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试小菜蛾来自仲恺农业工程学院昆虫实验室，在室内采用盆栽萝卜苗长期饲养，温度为（25土1）℃，湿度为70%～80%，光照周期为16L：8D。

主要试剂：RNA Kit I R6834购自广州飞扬生物工程有限公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，pMD20-T克隆载体、Prime-Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、ExTaq DNA聚合酶及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）荧光试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2小菜蛾总RNA提取和第一链cDNA合成

收集小菜蛾1～4龄幼虫、蛹及成虫等不同发育时期材料，取样后立即将样品放人液氮中冻存。试验中严格按照RNA试剂盒操作步骤提取小菜蛾总RNA，并用分光光度计和电泳检测RNA质量合格后，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒的说明进行操作，反转产物20℃贮存备用。

1.3引物设计和cDNA扩增

根据课题组前期转录测序获得的小菜蛾表皮蛋白部分基因序列，应用Primer Premier 5.0设计引物ICP-51和ICP-52，结合5′RACE试剂盒中提供的通用引物5′GeneRacer Primer和5′GeneRacer Nested Primer进行巢式PCR，获得PryICP 5′端cDNA序列。再根据扩增得到的5′端序列测序结果设计特异引物ICP-31进行扩增，得到PxylCP的3′端序列。3′和5′端序列用DNAMAN进行拼接获得PxylCP的全长cDNA，根据获得的全长cDNA序列设计1对引物ICP-ORF1和ICP-ORF2，用于PxyICP ORF序列验证。引物序列信息见表1。PCR反应体系50.00μL：5.00μLDNA聚合酶反应缓冲液，上、下游引物（10 mol/L）各2.00μL，4.00μL dNTP（2.5 mmol/L），0.25μLExTaq DNA聚合酶（5 U/μL），加灭菌超纯水补足至50.00μL。扩增程序：94℃预变性3 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，进行33个循环；72℃延伸10 min。5.00μL扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后与pMD20-T载体连接过夜，挑选阳性克隆并PCR鉴定后测序，由广州英骏生物技术有限公司完成测序。

1.4生物信息学分析

1.4.1 PxylCP序列特性分析 使用DNAStar将克隆获得的DNA序列翻译成蛋白质序列；使用SingnalP（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/）预测Pxy-ICP信号肽；利用TMHMMg对PxylCP蛋白进行跨膜运输分析；使用NetPhos（http：∥www.cbs.dtu.dk/servic-es/NetPhos/）预测PxylCP磷酸化修饰位点；使用Prot-Param（http：∥web.expasy.org/protparam）预测PxyICP的相对分子质量、等电点等；使用ProtScale（http：∥web.expasy.org/prot scale/）对PxylCP进行蛋白质亲疏水性分析。

1.4.2系统发育进化树分析 从NCBI网站（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）分别选取昆虫纲鳞翅目、半翅目、双翅目、膜翅目、虱目等共31个物种的昆虫表皮蛋白序列，与本研究克隆的小菜蛾表皮蛋白序列进行系统发育进化树分析。使用DNAStar的MegAlign程序，选择ClustalW的方法构建系统发育进化树。

1.5 PxyICP基因表达分析

根据cDNA序列信息设计荧光定量特异性引物PxyQF和PxyQR（表2），以actin基因为内参基因（引物为PactF和PactR），无菌超纯水为阴性对照，以2Pxy-ICP基因在1龄幼虫的表达量为标准参量，采用实时荧光定量PCR检测表皮蛋白基因PxyICP在小菜蛾不同发育时期的表达变化动态。每个样品重复3次。采用2-^ΔΔCt法计算PxyICP基因的相對表达量。

实时荧光定量PCR体系25.00μL：包含SYBR预混液（TaKaRa Code：RR820）12.50μL，引物（10μmol/L）各1.00μL，cDNA模板2.00μL，灭菌超纯水8.50μL。采用两步法进行PCR扩增：95℃预变性30 s；95℃5 s，60℃30 s，进行40个循环。

2结果与分析

2.1 PxyICP序列特征分析

从反转合成的小菜蛾cDNA中克隆获得表皮蛋白基因PxyICP。序列分析可知，PxyICP基因开放阅读框全长531 bp，编码177个氨基酸，相对分子质量约18.90 kD，等电点为5.32。PxyICP推导的氨基酸序列如图1所示。

用ProtScale分}）TPxyICP的亲疏水性，结果表明，PxyICP的平均亲水性是-80.256，为亲水性蛋白。SingnaIP预测结果显示，PxyICP的氨基末端第1～16位氨基酸是参与跨膜蛋白转移的信号肽（图1）。PxyICP的磷酸化修饰位点预测结果显示，PxyICP的氨基酸序列中分别含有10个丝氨酸、4个酪氨酸和2个苏氨酸磷酸化位点。将PxyICP的氨基酸序列与3种类型的R&R保守基序进行对比，可发现其与RR-1型保守基序匹配度较高，在保守的几丁质结合区仅有5个位点的氨基酸发生突变（图1）。在Prosite数据库（http：∥prosite.expasy.org/）中，PxyICP被鉴定为RR-1型表皮蛋白，且几丁质结合区域为第86～111位氨基酸（图1）。

2.2表皮蛋白的系统发育进化分析结果

为探究表皮蛋白在不同昆虫问的进化关系，本研究采用DNAStar的MegAlign程序对包括小菜蛾在内的31种昆虫表皮蛋白进行系统发育进化树分析。由图2可知，所选取的31条昆虫的表皮蛋白序列大致聚为五大类，分别对应双翅目、鳞翅目、膜翅目、半翅目和虱目昆虫的序列，较好地反映了物种间的进化关系。在五大类昆虫中，小菜蛾的表皮蛋白序列与鳞翅目昆虫的表皮蛋白聚为一类，且小菜蛾表皮蛋白与同属鳞翅目的金凤蝶（Papilio machaon Linnae-us）的表皮蛋白遗传距离最近，属于同一分支；而与同属鳞翅目的玉带凤蝶（P.polytes）、柑橘凤蝶（P.xuthus）和烟草天蛾（Manduca sexta）的表皮蛋白亲缘关系相对较远。

2.3 PxyICP基因在小菜蛾不同发育时期的表达

以1龄幼虫中PxyICP mRNA表达量为标准参量，利用实时荧光定量PCR分析PxyICP基因在小菜蛾不同发育时期中表达量的差异，结果如图3所示。由图3可知，PxyICP基因在小菜蛾发育的各个时期均有表达，在1～4龄幼虫的表达量均较低，在2、3、4龄幼虫中的表达量分别是1龄幼虫的243%、51%和63%；在蛹和成虫中PxyICP的表达量大幅度增加，其在蛹和成虫中的表达量分别是1龄幼虫的3.19和12.32倍，其中在成虫中的表达量最高。

3讨论

几丁质和表皮蛋白是构成昆虫表皮的主要成分，而CPR家族是昆虫表皮蛋白五大家族中最大的一个家族，其包括RR-1、RR-2和RR-3等3种亚族。本研究克隆获得小菜蛾表皮蛋白基因，命名为PxyICP，氨基酸序列分析结果表明该基因编码的蛋白具有16个氨基酸的信号肽，预测该蛋白可能为分泌型蛋白。PxyICP基因编码的蛋白具有RR-1保守基序的典型特征[G-x（8）-G-x（6）-Y]，属于CPR家族中的RR-1亚族，但在保守的几丁质结合区具有5个氨基酸发生突变。Hamodrakas等（2002）研究证明保守基序中的芳香族氨基酸残基（主要为酪氨酸Y和苯丙氨酸P）在与几丁质的结合过程中发挥重要作用。而PxyTICP序列由保守基序中的氨基酸F突变为氨基酸Y，这将可能会加强PxyICP蛋白与几丁质的相互结合。大部分RR-1型表皮蛋白主要存在于昆虫幼虫表皮和节问膜等较软的角质层中（Noh et al.，2016）；但意大利蜜蜂（Apis mellifera）的RR-1型表皮蛋白AmelCPR14主要与蜜蜂成虫蜕裂后期表皮的鞣化和变黑有关（Karouzou et al.，2007；Soares et al.，2007）。家蚕RR-1型表皮蛋白基因BmorCPR2的缺失致使家蚕幼虫节间褶增长和节问显著隆起而导致畸形（Qiao et al.，2014）。

表皮蛋白基因在昆虫不同发育时期的表达具有一定特异性。褐飞虱的表皮蛋白基因NlICP在3龄幼虫期表达量最高，而在成虫期几乎不表达，NlICP与褐飞虱若虫表皮的发育及蜕变有关（马艳等，2013）。西方蜜蜂表皮蛋白基因AmelTwdll和AmelT-wdl2在成虫中的表达量最高（Soares et al.，2011）。冈比亚按蚊CPF表皮蛋白家族基因CPFL2-7基因在幼虫期高表达，表明其可能参与幼虫表皮的形成（Togawa et al.，2007）。本研究对PxyICP基因的发育表达模式分析结果表明，PxylCP基因在小菜蛾不同发育时期均有表达，但在成虫期表达量最高，暗示PxyICP基因可能与小菜蛾成虫蜕变后期表皮的硬化变黑或与成虫形成特殊表皮抵御外界不良环境等生理功能有关。因此，以表皮蛋白PxyICP为靶标开展小菜蛾防治研究，即有可能抑制小菜蛾的正常生长发育和提高现有杀虫剂的毒杀效果而达到有效控制小菜蛾的最终目的。

4结论

本研究克隆了小菜蛾PxyICP基因，该基因序列具有昆虫表皮蛋白CPR家族中RR-1型保守基序的典型特征。不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明，PxyICP在小菜蛾各发育时期均有表达，但在成虫中的表达量最高，推测PxyICP蛋白参与小菜蛾成蟲表皮的硬化和黑化等生理过程。