椰子萌发过程中吸器内含物的变化规律

李静　王仁才　杨耀东　吴翼　范海阔　弓淑芳

摘要：【目的】探讨椰子萌芽过程中吸器内含物的变化规律，为提高椰子种果发芽率及促进椰子产业可持续发展提供参考依据。【方法】统计新鲜成熟的本地高种和红矮椰子吸器发育过程中椰果的果实重量、纵横径、水含量、椰肉厚度及吸器重量和纵横径，使用紫外分光光度计测定，并分析本地高种椰子吸器萌发过程中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及可溶性蛋白和多酚含量等各组变化情况。【结果】椰果内的液态胚乳随着椰子吸器发育过程中体积与重量的增大逐渐减少直至完全被吸收，白色硬质状椰肉逐渐被吸收软化且变褐色；多酚和可溶性蛋白含量逐渐减少，SOD和POD活性呈先上升后下降的变化趋势；内含物间具有密切的相关性，其中，多酚含量与SOD活性呈显著负相关（P<0.05，下同），与可溶性蛋白含量呈极显著正相关（P<0.01）；POD活性与可溶性蛋白含量呈显著负相关，与SOD活性呈显著正相关。【结论】新鲜成熟椰果的吸器在发育过程中具有较高的SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量，用作繁殖材料可获得较佳的育苗效果。

关键词：椰子；吸器；萌发；SOD活性；POD活性；多酚含量

中图分类号：S667.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）12-2163-06

0引言

【研究意义】椰子（Cocos nucifera L.）是棕榈科椰子属多年生乔木，其果实是营养丰富的天然有机食品，具有极高的经济价值（Xu et al.，2007；Marinaet al.，2009），培育优良椰子品种和优良种苗，是发展椰子种植业的重要前提和保证。我国椰子产业发展目前存在品种单一、产量较低、病虫害较多和树体老化（Cordova et al.，2003）及飓风和海啸等逆境危害的问题（Samosir and Adkins，2014），导致椰子供需矛盾突出。椰子主要以种子进行繁殖，商业化制种程序繁琐、种子萌发周期长且萌芽率低（仅40%）、生产成本较高。椰子吸器（Haustorium）是其种子萌发的特殊产物，是椰果逐渐膨大过程中充满整个椰腔的海绵状吸收器官，可分泌脂肪酶、纤维素酶和蛋白酶等将椰子果实的脂肪和蛋白质转化为可溶性养分，通过维管系统供给椰子苗生长，对椰子种子萌发起着重要作用（陈良秋和万玲，2007），但目前有关椰子吸器的形成机理及其对椰子种子萌发所起作用了解甚少。因此，探讨椰子萌芽过程中吸器发育及内含物的变化规律，对培育优质椰子种苗及促进椰子产业发展具有重要意义。【前人研究进展】植物胚性细胞发育过程中各种生理生化反应均有大量特异性酶如过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）合成并参与代谢。詹园凤等（2006）研究发现，大蒜体细胞胚胎发生过程的SOD和POD活性变化与胚性愈伤组织诱导及体胚发育密切相关，POD对体胚的诱导起主导作用，SOD在体胚发育和成熟中起主导作用。林玉玲和赖钟雄（2007）对红核子龙眼胚胎发育过程中的SOD活性进行测定，结果表明，在龙眼子叶形胚发育早期，SOD活性迅速升高，之后上升较平缓。董姝娟和郭修武（2008）研究发现，金星葡萄胚胎发育过程中SOD、POD活性呈增高趋势，可能与其无核败育有关。陈义挺等（2009）研究发现，随着龙眼胚性细胞的分化，POD活性总体呈下降趋势。除酶活性变化外，组织内含物的变化也是体胚发育的重要指标。可溶性蛋白是种子中重要的渗透调节物质和营养物质，对细胞的生命物质及生物膜起保护作用。植物在逆境条件下可通过增加可溶性蛋白的合成，直接参与其适应逆境过程（张明生等，2003）。多酚类物质是植物种子中重要的内含物，普遍具有抗菌、抗氧化及抗癌等生物活性，且已被证实有利于植物生长（Randhk and Shetty，2003），多酚的存在是导致植物组培褐变的主要因素（张振霞和洪萍，2010），研究其在种子中含量的变化规律有助于有效减少胚培养过程中的褐变现象。Manivannana等（2016）研究表明，干燥椰子吸器的主要成分为可溶性糖、淀粉、不溶性膳食纤维、可溶性膳食纤维、蛋白质、脂肪、灰分和微量酚类。Konan等（2017）对室温存储1个月后的马来西亚黄矮（MYD）椰子在苗圃催芽，并对萌芽2和4个月的椰子吸器进行生化分析，结果表明，其油含量从12.90%）2升N37.30%，而可溶性糖主要为蔗糖、果糖和葡萄糖。【本研究切入点】吸器是椰子种苗繁育的重要组织，其发育过程中内含物的变化直接影响发芽率，但目前针对椰子吸器萌发过程中SOD和POD活性及可溶性蛋白和多酚含量等内含物变化的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】在统计不同椰子品种不同季节种果发芽率的基础上，探讨本地高种椰子吸器萌发过程中SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量的变化规律，找出提高其种果发芽率的突破口，为椰子产业健康发展提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试椰子品种为本地高种和红矮，以未发育（T0）及发育到椰腔1/8（T1）、1/4（T2）、1/2（T3）、充满整个椰腔但椰苗较小（高度小于50 cm）（T4）和充满整个椰腔且椰苗发育粗壮（苗高达1 m）（T5）椰苗的椰子吸器为试验材料（图1）。椰子果实于2016年在中国热带农业科学院椰子研究所育苗基地进行沙培。

主要试剂：福林酚（>99.0%）购自阿拉丁上海晶纯生化科技股份有限公司；没食子酸（>99.0%）购自麦克林上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、无水碳酸鈉、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均购自广州化学试剂厂；SOD、POD活性和可溶性蛋白含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。主要仪器设备：KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、离心机（Eppendorf 5801R型，德国艾本德公司）、紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2椰子发芽试验及不同发育时期基础数据统计

选取成熟的本地高种和红矮椰果分批进行沙培，定期浇水，统计椰子出芽率。对不同发育期本地高种椰果（因每个发育期采样均需3次重复，而红矮发芽后椰子总数偏少，故后续研究均以本地高种椰子为试材）测定其果实重量和纵横径后剖开果实分别测定水含量、椰肉厚度、吸器重量及纵横径。

1.3多酚含量测定

1.3.1多酚提取 准确称取各发育期本地高种椰子吸器2.0 g，加/k5.0 mL 80%乙醇用研钵研磨，充分匀浆，小心转移至15.0 mL离心管中，残渣用5.0mL提取液再研磨一遍充分洗涤后合并至15.0 mL离心管中；密封后40℃水浴，超声波提取50 min（期间可振荡混匀2～3次），室温条件下4000 r/min离心10min；取0.5 mL上清液置于10.0 mL离心管中，依次加入2.5 mL 10%福林酚反应5 min后加入2.0 mL 7.5%Na₂CO₃，室温下暗处反应40 min，用紫外可见分光光度计在波长765 nm处测定吸光值。

1.3.2标准曲线制备 取没食子酸（100μg/mL）0、50、100、200、300和500μL分别用蒸馏水补足体积N500 μL，然后依次加入2.5 mL 10%福林酚反应5min后，再加入2.0 mL 7.5%Na₂CO₃，室温下暗反应40 min，用紫外可见分光光度计在波长765 nm处测定吸光值，得到标准曲线y=0.0102x+0.03（R²=0.9979）。

1.3.3多酚含量计算 按照等量没食子酸计算本地高种吸器的多酚含量。

1.4 SOD和POD活性测定

分别称取各发育期本地高种吸器1.0 g用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.1）按重量（g）：体积（mL）=1：9提取SOD和POD，冰浴条件下制成10%组织匀浆液，3500 r/min离心10 min后取20μL上清液按照操作说明测定SOD活性，取100 μL上清液按照操作說明测定POD活性。

1.5可溶性蛋白含量测定

取各发育期本地高种吸器1.0 g用5%生理盐水按重量（g）：体积（mL）=1：9提取可溶性蛋白，冰浴条件下制成10%组织匀浆液，3500 r/min离心10 min后取50μL上清液按照操作说明测定可溶性蛋白含量。

1.6统计分析

试验数据采用SAS 9.1进行方差分析和相关性分析。

2结果与分析

2.1不同发芽时期本地高种和红矮椰子的出芽情况

由表1可看出，本地高种椰子春（3月）、夏（6月）和秋季（10月）的发芽率分别为51.0%、33.0%和58.8%，平均为47.6%，红矮椰子在夏季（8月）和秋季（10月）的发芽率分别为27.2%和43.8%，平均为35.5%。说明炎热夏季（6～8月）椰果的出芽率明显低于春季（3月）和秋季（10月），生产上应选择成熟、无冻伤及响水声较大的新鲜成熟老果在天气凉爽时进行育苗。

2.2本地高种吸器发育过程中椰果各部位的变化情况

由表2可看出，在本地高种吸器发育过程中椰果各部位的变化差异明显，其中，吸器的纵横径在T0期分别为1.2和0.8 cm，T5期分别发育生长至10.2和9.8 cm；吸器重量在T0期为0.26 g，T4期发育至287.20 g；苗长在T0期为0，T5期发育生长至104.0cm；椰果内的椰子水含量从T0期的350 mL逐渐下降，至T5期被完全吸收；椰肉由T0期的硬质状、厚1.5 cm变为T5期的柔软黏稠状、厚0.5 cm。吸器所占整个椰果的比重也在逐渐增加，由T0期的0.015%增加到T4期的13.611%，但在椰苗生长至T5期时吸器所占比重下降到8.000%，推测为吸器中的养分逐渐供给椰苗生长而导致其比重下降。

2.3本地高种椰子吸器SOD和POD活性的变化情况

从图2可看出，本地高种椰子吸器的POD和SOD活性均呈先上升后下降的变化趋势，POD活性在吸器发育至T4期时达最大值，随后下降。吸器各发育时期的POD活性排序为T4>T5>T3>T2>TI>T0，SOD活性排序为T3>T4>T5>T2>T1>T0；方差分析结果表明，吸器各发育时期的POD活性间、SOD活性间差异显著（P<0.05，下同）。说明SOD和POD活性对椰子吸器发育初期逐渐增大起主导作用。

2.4本地高种椰子吸器可溶性蛋白含量的变化情况

从图3可看出，在椰子吸器发育过程中可溶性蛋白含量逐渐下降，由T0期的0.34 g/L下降至T5期的0.12 g/L，且各发育期间差异显著。说明椰子吸器发育过程对可溶性蛋白的消耗明显，为幼苗发育提供了充足的能量。

2.5本地高种椰子吸器多酚含量的变化情况

从图4可看出，椰子吸器的多酚含量随其发育进程呈先下降后略有上升的变化趋势，由410.00μg/g逐渐下降至185.29μg/g；T0与T1时期的多酚含量差异不显著（P>0.05，下同），T1与T2时期、T2与T3时期、T3与T4时期及T4与T5时期的多酚含量差异显著。多酚含量在吸器发育初期较高，随后下降，说明多酚参与了椰子吸器的发育过程，可促进吸器变大和椰苗变高。

2.6本地高种椰子吸器各组分间的相关性分析结果

对椰子吸器的多酚含量、POD和SOD活性及可溶性蛋白含量进行相关性分析，结果（表3）表明，多酚含量与SOD活性呈显著负相关，相关系数为-0.83，多酚含量与可溶性蛋白含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.94；POD活性与可溶性蛋白含量呈显著负相关，相关系数为-0.82；SOD活性与可溶性蛋白含量的相关系数为-0.78，相关性不显著；POD活性与SOD活性呈显著正相关，相关系数为0.47。说明在椰子吸器发育过程中内含物的变化总体上相辅相成，互相利用。

3讨论

目前采用组培技术生产椰苗尚属世界性难题，椰子种苗繁育只能以成熟椰果为种源，育苗成活率低，周期长，且易受不同品种及不同成熟期影响，因此选择较合适的椰果进行育苗才能节省椰果和提高育苗成活率。吸器作为椰子胚发育的关键器官，研究其内含物变化有助于理清椰子胚发育机理和确定吸器作为食品的一些评判指标。林玉玲和赖钟雄（2007）研究发现，SOD可清除活性氧，促进龙眼体细胞胚的发生；Lin和Lai（2010）研究认为，SOD在体细胞胚发生分裂的早期起关键作用。本研究中，椰子吸器发育过程中SOD和POD活性均较高，可促进椰子吸器发育，对椰子种苗繁育起重要作用；多酚含量最高为410.00 μg/g，高于李一伟等（2012）对萍婆胚测定的多酚含量，表明多酚不仅在椰子发育中发挥重要作用，其含量还可作为高酚含量水果开发利用的参考指标。

吸器的多酚含量、POD和SOD活性及可溶性蛋白含量问有较密切的相关性，多酚含量与SOD活性呈显著负相关，与可溶性蛋白含量呈极显著正相关，对应的相关系数分别为-0.84和0.94；POD和SOD活性与可溶性蛋白含量呈负相关，表明这些活性物质问相辅相成，在椰子吸器发育过程中起相互促进作用。Chikku和Raiamohan（2012）研究发现，椰子吸器水提取物对大鼠心肌梗死有显著的保护作用和抗氧化性能，本研究中吸器的多酚含量、SOD和POD活性较高，其抗氧化功能也较强，具有作为椰果另一个可食部分开发利用的潜力，但需进一步对吸器的其他营养成分进行检测，才能更完整地评价其食用价值（Manivannan et al.，2016）。

4结论

新鲜成熟椰果的吸器在发育过程中具有较高的SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量，用作繁殖材料可获得较佳的育苗效果。