微生物絮凝剂产生菌筛选和廉价培养

秦国凤 邓冬梅

摘 要：微生物絮凝剂具有安全高效的特点，具有巨大应用潜力.为开发更多微生物絮凝剂，本研究从活性污泥中分离纯化高效絮凝剂产生菌株，初步确定其活性成分分布，并探讨利用糖蜜废液对其廉价培养的可行性.研究结果表明，16株能产生微生物絮凝剂的菌株中，呈革兰氏阴性的Y3和S1菌株的微生物絮凝特性最好，对高岭土悬浊液絮凝率分别达到98.9%和99.5%，其絮凝有效成分多为细胞外产物.稀释20倍、40倍和60倍的废糖蜜中菌株Y3和S1均可生长，在稀释40倍的废糖蜜中两种菌生长量均最大，且在废糖蜜中均保持了絮凝特性，表明糖蜜废液可用于Y3和S1菌株的廉价培养.

关键词：微生物絮凝剂；廉价培养；絮凝率；糖蜜

中图分类号：X703 文献标志码：A

0 引言

目前絮凝沉降技术已被广泛应用于给水、废水处理[1-2]和污泥脱水[3]，其中的絮凝剂是一种可使液体中不易沉降的固体悬浮颗粒凝聚沉降的物质[4]，主要有微生物絮凝剂，无机絮凝剂和有机合成高分子絮凝剂等.微生物絮凝剂，是由微生物产生或代谢的具有絮凝活性的天然生物高分子絮凝剂；无机絮凝剂有铝盐，铁盐等；有机合成高分子絮凝剂如聚丙烯酰胺.研究表明[5]：长期使用以铝盐为絮凝剂的水会引起老年痴呆症；铁盐类对金属设备具有腐蚀性；聚丙烯酰胺类单体物质具有强烈的神经毒性，且有较强的“三致”效应，许多领域已被禁止或限量使用.而微生物絮凝剂化学成份主要为多糖，蛋白质，糖蛋白，纤维素和DNA，是具有生物分解性和安全性的高效、无毒、无二次污染的绿色水处理劑，可以克服传统型絮凝剂本身固有的缺陷，因此，成为当今世界絮凝剂方面研究的重要课题[6-8].但由于其培养费用高，发酵生产工艺不成熟，且絮凝效果不稳定等缺点，使得微生物絮凝剂还未广泛生产和应用.至今发现并鉴定出的絮凝剂产生菌已经数十种，其种类繁多，包括霉菌、细菌、放线菌和酵母菌等[9].我国是制糖大国，糖蜜废液是甘蔗制糖副产品，若能作为微生物的培养基，既可节省培养成本，又可废物利用.本实验分别通过3种培养基对不同菌种进行筛选，最后选用絮凝率高的菌株进一步研究其生长情况，并对其进行初步鉴定，确定其活性成分分布，探讨用糖蜜废液做廉价培养的可行性.

1 材料与方法

1.1 菌株筛选

实验分别采用察氏培养基筛选霉菌，用高氏一号培养基筛选放线菌，用酵母菌培养基筛选酵母菌，培养基配方如表1所示.

按表1中试剂的量进行称取混合，并调好pH后，经121℃灭菌30 min.

在10 mL纯水中加入脱水污泥1 g，180 r/min振荡15 min后，将0.2 mL菌种稀释液接种于60 mL的富集培养基中，在固体培养基上（在表1相对应的培养基基础上加15 g～20 g琼脂粉即可制成对应的固体培养基）对培养3 d后稀释为l0-5，10-6，10-7的菌液进行划线分离培养.选择优秀菌落进行划线分离（8次～10次），把纯化的菌株在28 ℃，180 r/min条件下摇床培养，2 d后进行絮凝率测定.

1.2 絮凝率

2 mL菌液加入100 mL 5 g/L高岭土悬浊液中，快搅2 min，慢拌5 min，静沉5 min后，在550 nm波长处测上清液吸光度（K），同时以2 mL纯水代替菌液作为对照（M）.絮凝率=（K-M）/M.

1.3 生长曲线和活性成分分布

分别在24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，测定在28 ℃，180 r/min摇床培养环境下，接种有纯化菌株2 mL的50 mL发酵液中菌株生长情况和絮凝率.生长情况以在波长660 nm处的OD值表示.活性成分测试：取菌液5 mL，3 000 r/min冷冻离心15 min，分离出的上清液和沉淀分别用纯水补充到5 mL，加进高岭土悬浊液中测其上清液絮凝率.

1.4 糖蜜废液廉价培养

分别在100 mL稀释40倍、60倍、80倍的糖蜜废液（稀释后调至pH 5，在121 ℃灭菌30 min）中各加入所筛选出的菌株发酵液2 mL，180 r/min，28 ℃环境下摇床培养，测生长曲线及絮凝率.

1.5 菌种初步鉴定

通过观察菌株生长形态，并对单菌落观察和载片培养、革兰氏染色，最后在油镜下观察形态特征进行初步鉴定.

2 结果与分析

2.1 微生物絮凝剂产生菌筛选

通过平板分离纯化培养，从活性污泥获取16个菌株，将所获取的菌株进行6次～7次的纯化分离后进行发酵培养，2 d后用高岭土悬浊液测定絮凝率.结果如表2所示.

从表2中可看出，所获得的菌株中，酵母培养基所培养筛选得的菌株絮凝率普遍较高，都大于90%，从中选取絮凝率最高的菌株Y3，S1做为下步实验菌株.

2.2 所筛选菌株的初步鉴定

图1为Y3与S1菌落细胞经过革兰氏染色后的形态，从中可看出Y3细胞经革兰氏染色后显红紫色，是革兰氏阴性菌；在10×100高倍显微镜下呈短棒状.S1细胞经革兰氏染色后显红紫色，是革兰氏阴性菌；在10×100高倍显微镜下呈椭圆形，晶莹透亮，一端或两端着红色.

2.3 Y3与S1菌株的生长及絮凝特性

2.3.1 生长曲线 由图2曲线可知：两种菌株的絮凝率与生长情况都有很好的对应关系，在Y3菌体量迅速增加的生长早期，絮凝率随之上升，发酵液的絮凝率随着细胞增长量的增加而同步上升的现象与李旭等[10]的实验结果一致.第2 d，第3 d，第4 d菌体量稳定，絮凝能力维持不变；第4 d后细胞开始衰亡，絮凝率跟着迅速下降，这与文献[11]报告的随时间的延长，菌体生长变慢，絮凝活性有所下降的结论相吻合.S1与Y3相似，但S1产生絮凝物质比较迟缓，平稳期稍短.由此推断：絮凝物质随着菌株的增长而产生，随体系中解絮凝活性酶的产生或营养物质的耗尽不再产生，Y3和S1有效絮凝活性成分可能与细胞分泌物有关.实验表明，最好是在对数生长期或稳定早期收获微生物絮凝剂，此时，絮凝活性最高.

2.3.2 絮凝活性成分分布 由图3可知，菌株Y3，S1上清液的絮凝率都高于沉淀的絮凝率，由实验得到Y3和S1全菌液、离心后上清液、和沉淀（菌悬液）的最高絮凝率分别为90.2%，85.4%，70%和85.9%，73.3%，30.2%.由此可见，在离心后的Y3和S1上清液和发酵液中都存在絮凝活性成分，上清液中絮凝活性高，沉淀（菌悬液）中的絮凝活性较低.结果可见：絮凝剂是由微生物产生的具有絮凝活性的代谢产物，和马放等[12]的研究报道结果类似.

2.4 Y3和S1菌株在糖蜜废液中的廉价培养

由图4可知：菌株Y3与S1在40，60，80三个不同稀释倍数的糖蜜废液中生长情况类似，第1 d，第2 d增长迅速，最大增长都出现在第3 d，两个菌株在糖蜜废液稀释倍数40 倍的情况下，OD值都达到最大，稀释倍数为80倍的情况下，OD值最低.Y3与S1对比：Y3菌株在被稀释的糖蜜废液中生长情况比S1菌株明显旺盛，相同接种量情况下，S1菌株在3个不同稀释倍数的糖蜜废液中的OD值均是Y3菌株的1/2，所以：糖蜜废液中的物质更易被Y3菌株所吸收利用，更适合Y3菌株生长.

结果表明：可以用稀释后的糖蜜废液对絮凝剂产生菌进行培养，但不同的菌株培养效果存在差异.

2.5 Y3和S1菌株在糖蜜废液中的絮凝率

由图4～图5可知：Y3菌株在第1 d～第3 d， OD值明显增长，但絮凝率增长平缓；S1菌株的生长趋势与絮凝率呈现出一定的对应关系.两個菌株都在第3 d出现最大OD值和絮凝率，第4 d，第5 d OD值和絮凝率都迅速下降.

由图5可见，在稀释倍数相同的糖蜜废液中，两个菌株的絮凝率不同，在稀释40倍，60倍，80倍的糖密废液中第1 d～第3 d，Y3菌株絮凝率增长平缓，S1菌株絮凝率增长明显，但两菌株都在第3 d达到最大絮凝率.Y3和S1菌株在稀释40倍的糖蜜废液中絮凝率达到最大分别为90.5%和 75.6%，在富集培养条件下的Y3和S1全菌液最大絮凝分别为：90.2%和85.9%，两者相比，S1菌株的絮凝率稍有下降.与刘杏等[13]尝试以糖蜜废液作为絮凝剂产生菌，实验结果相似.本试验用糖蜜稀释液做为培养基培养Y3和S1菌株，絮凝率最大可达到90.5%和75.6%，说明所筛选的菌株用糖蜜废液作为替代培养基是适合的，且Y3菌株比S1菌株更为适合.

3 讨论

1）其它相关微生物絮凝剂产生菌的筛选及优化[14-15]通过优化培养条件（pH、温度、培养时间等）和培养基组分来提高菌株絮凝率，本试验则是在培养条件固定的情况下试验糖蜜废液是否适合作为其培养基.两者相比：本实验的优势在于降低微生物培养成本；不足之处是固定培养条件，限制了不同菌株达到自身最佳的絮凝效果，所以在本试验的基础上需要进一步优化各菌株的培养条件以达到各自的最佳絮凝效果.

2）本实验中只以高岭土悬浊液做为絮凝的主要实验对象，实际应用中，还需进一步用所筛选的菌种对其它废水进行絮凝实验，研究其实际应用的潜力.对于同时含有色度和浊度的废水，可以参照化学混凝与活性炭吸附联用处理水源水研究[16]，用所筛选的菌种与其它技术联用进行处理研究.

3）本实验中絮凝率测试中固定了絮凝时投加菌种的量，因而在做絮凝实验时，两个菌株所投加的最佳菌液量需要进一步验证.

4）可通过16S rDNA序列分析法对菌株进行进一步的鉴定.

4 结论

本试验从活性污泥中筛选所得的菌株Y3和S1是相对高效的絮凝剂产生菌株，絮凝剂的活性成分由微生物体产生并分泌到细胞外形成具有絮凝活性的物质.用糖蜜废液对Y3和S1菌株进行培养，Y3和S1菌株都能保持相对稳定的生长和絮凝活性，说明糖蜜废液中碳源、氮源等营养因子能较好地被Y3和S1所利用，糖蜜废液能用于Y3和S1的廉价替代培养基.

参考文献

[1] 魏旭.试论微生物絮凝剂在污水处理中的应用[J].企业技术开发，2009，28（10）：16，20.

[2] 王宗华，曹邦卿，赵玉彬.生物絮凝在校园生活污水处理中的应用研究[J].环境科技，2009，22（3）：47-51.

[3] 张娜，尹华，秦华明，等.微生物絮凝剂改善城市污水厂浓缩污泥脱水性能的研究[J].环境工程学报，2009，3（3）：525-528.

[4] 袁宗宣，郑怀礼，舒型武.絮凝科学与技术的进展[J].重庆大学学报（自然科学版），2001，24（2）：143-147.

[5] 张本兰. 新型高效、无毒水处理剂-微生物絮凝剂的开发与应用[J].工业水处理，1996，16（1）：7-8.

[6] 彭辉，尹华，梁郁强，等. 微生物絮凝剂产生菌的培养及其化学特征初探[J]. 环境科学与技术，2002，25（1）：6-8.

[7] 刘紫鹃，徐桂云，刘志培，等. 絮凝剂BP25的化学组成及结构研究[J]. 微生物学报，2001，41（3）：348-351.

[8] 王春梅，胡啸林，章忠秀.有机高分子絮凝剂的合成及其应用[J].工业用水与废水，2002，33（1）：33-35.

[9] 刘立凡，聂锦旭. 中国微生物絮凝剂的生产研究现状[J].环境污染与防治，2007，29（4）：276-279.

[10] 李旭，李小明，杨麒，等. 一株絮凝剂产生菌的筛选及其絮凝特性研究[J].生物技术，2007，17（1）：33-37.

[11] 陶然，杨朝晖，曾光明，等.微生物絮凝剂产生菌的筛选、鉴定及其培养条件的优化研究[J].中国生物工程杂志，2005，25（8）：76-81.

[12] 马放，李淑更，金文标，等. 微生物絮凝剂的研究现状及发展趋势[J].工业用水与废水，2002，33（1）：7-9.

[13] 刘杏，邵林广，张丽芳.生物絮凝剂的研究现状及发展趋势[J]. 孝感学院学报，2001，21（6）：39-42.

[14] 杨延梅.微生物絮凝剂产生菌的筛选及其培养条件研究[C]//中国生态学会微生物生态专业委员会年会论文集.新乡：中国生态学会微生物生态专业委员会暨国际研讨会，2007.

[15] 朱丹，苏鸿雁，岳玉春.微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养条件的优化研究[J].大理学院学报（综合版），2010，9（4）：73-75.

[16] 邓冬梅，肖林成，孙宇飞，等. 化学混凝与活性炭吸附联用处理水源水研究[J].广西工学院学报，2013，24（3）：1-4.

Abstract：As microbial flocculant is safe and efficient， it has an extensive development and application potentiality. To find more microbial flocculant， this research screened strains producing microbial flocculants from sludge， explored the distribution of the active ingredient， and discussed the feasibility of using molasses wastewater as its cheap nutrient medium. The results showed that two gram-negative strains， named Y3 and S1 had the highest flocculating activity among the 16 strains isolated， and the flocculating rate of Y3 and S1 reached 98.9% and 99.5% respectively when using their fermentation liquid to treat kaoline soliquoid. Moreover， the flocculation effective components of the two strains were both extracellular products. Y3 and S1 both could grow in the 20， 40 and 60 times diluted molasses， and the growth of the two bacteria were best in 40 times diluted molasses growth were the biggest. Furthermore， the flocculation characteristics of the two strains both maintained in diluted molasses. The results suggested that molasses waste liquids can be served as cheap culture medium for the propagation of Y3 and S1.

Key words： microbial flocculant； cheap culture； flocculation rate； molasses

（學科编辑：黎 娅）