果蔬农药残留快速检测固定化酶片的制作研究

张登科 郝程列 钟凯

摘要 [目的]对胆碱酯酶的保藏性进行研究分析，以期得到保障农药残留检测的最佳酶活力。[方法]试验选定高酶活力的大豆酯酶为酶原，通过筛选最适反应温度、反应时间、离子浓度和最适pH，及最佳的反应显色体系来确定反应最适的条件，采用不同的显色体系酶抑制法，研究酶片的制作方法。[结果]酶片载体材料采用硝酸纤维膜，制作每张酶片取20 μL大豆酶液，15 μL 0.5%的BSA溶液，2 μL 0.05%戊二醛于平底试管中。添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液至总体积100 μL，4 ℃固定10 h；制作每张显色片，需在1 cm×1 cm大小的滤纸片上加入50 μL显色剂，30 μL底物，4 ℃冷风吹干，封膜真空保存。[结论] 固兰B盐和α-乙酸奈酯组合，适合作为酶抑制法检测有机磷农药残留的显色剂，且效果明显。

关键词 大豆；胆碱酯酶；农药残留；酶片

中图分类号 TS207.5+3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0081-04

Abstract [Objective]The preservation of cholinesterase was studied in order to guarantee the best enzyme activity of pesticide residue detection. [Method] The soybean esterase with high enzyme activity was selected as zymogen， optimum reaction conditions by screening the optimal reaction temperature， reaction time， concentration and pH， reaction and the best color system were determine.The method of making enzyme tablets was studied by using different color system and enzyme inhibition method.[Result]Nitrocellulose membrane was used for enzyme piece of material， which made each enzyme take 20 μL soybean enzyme liquid， 15 μL 0.5% BSA solution， 2 μL 0.05% glutaraldehyde to the bottom of the tube.Add 0.03 mol/L pH 7.0 phosphate buffer and the total volume was 100 μL， 4 ℃ fixed 10 h.Made each color piece， should add 50 μL chromogenic agent in 1 cm×1 cm filter size， 30 μL substrates， 4 ℃ cold wind blow dry， sealing membrane vacuum preservation. [Conclusion]The combination of solid blue B salt and αnaphthyl acetate is suitable for the detection of organophosphorus pesticide residue by enzyme inhibition method， and the effect is obvious.

Key words Soybean；Cholinesterase；Pesticide residues；Enzyme slices

農藥残留是农药使用后一个时期内未被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水源、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称[1-2]。农药残留检测酶抑制法，是基于农药的毒性机理来进行测定的，农药在生物体内能与乙酰胆碱酯酶结合，且不易分离[3-4]，乙酰胆碱酯酶的活性受有机磷和氨基酸甲酸酯类农药的特异性抑制，丧失了水解底物的活力[5]，致使神经传导中的乙酰胆碱不能水解而积累，影响神经的信号、递质的正常传递，神经持续兴奋，发生抽搐等，导致昆虫中毒甚至死亡[6]。根据有机磷农药对酶促反应具有抑制作用这一毒理学特性，建立了酶抑制法检测农产品中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留[7-8]。其中由于植物酯酶的成本大大低于动物性的乙酰胆碱酯酶，且来源广泛易得，因此植物酯酶抑制法测定农药残留是一种很经济适用的方法[9-10]。该试验着重研究酶抑制法的关键工作酶——植物酯酶，从大豆中提取植物酯酶，将提取出来的植物胆碱酯酶固定到载体上，制作成快速检测酶片，提高酶活力，也探究提高植物酯酶的保藏期，解决胆碱酯酶难以保存的问题，用于农药残留的快速现场检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与主要试剂。

东北大豆，购自天津红旗农贸市场；α-乙酸奈酯，天津伞科技有限责任公司；硝酸纤维膜（NC），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；牛血清白蛋白（BSA），Ruibio分装，合肥博美生物科技有限责任公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、丙酮、戊二醛、苯，均为分析纯，购自天津市化学试剂三厂；氧乐果，天津京津农药厂。

1.1.2 主要仪器设备。

JJ-2型组织捣碎匀浆机，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；EX224电子天平，奥豪仪器（上海）有限公司；国华SHZ-82恒温振荡器，常州国华电器有限公司；LD5-2B低速离心机，北京雷勃尔离心机有限公司；722N可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；LGJ-18S冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶液制备。

大豆用组织捣碎机粉碎成粉末，按料液比1∶5（g∶mL）分别称取适量的大豆粉，加入pH 7.0 浓度为0.03 mol/L的磷酸缓冲液，4 ℃浸泡12 h后振荡30 min，以5 000 r/min离心10 min，上清液滤纸过滤得到粗酶液，冷藏备用，同时测定粗酶液酶活力。

1.2.2 大豆酯酶最适反应条件。

1.2.2.1 最适反应温度。

分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃下测定酶活力，确定最适反应温度。

1.2.2.2 最适pH测定。

分别在pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的缓冲液中测定酶活力，确定最适pH。

1.2.2.3 确定缓冲液的最适离子浓度。

设定缓冲液的离子浓度分别为0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045 mol/L，分别测定其酶活力，绘制曲线图，确定其最适离子浓度。

1.2.3 酶活力的测定。

1.2.3.1 原酶液吸光度值的测定及不同用量顯色剂时溶液的显色效果。

在试管中加入20 μL酶液和2.40 mL pH 7.0的磷酸缓冲液（对照管加2.45 mL），然后加入50 μL底物α-乙酸奈酯溶液，将试管都置于30 ℃水浴中反应15 min，向各试管中再加入50 μL固兰B液，放在30 ℃水浴锅中反应10 min，立即在波长595 nm处测定吸光度[4]。

1.2.3.2 2种显色剂对比试验。

该试验分别采用固兰B盐和2，6-二氯酚靛酚钠作显色剂进行效果对比，添加相同量的农药稀释液，测定吸光度值，计算酶抑制率，比较显色剂的效果。

1.2.3.3 抑制率计算方法。计算公式如下：

抑制率（%）=[（△A0-△At）/△A0]×100%

式中，△A0为对照管吸光度值；△At为抑制管吸光度值。

1.2.4 农药氧乐果不同稀释浓度下对酶的抑制率。

该试验将农药氧乐果分别稀释成不同浓度，稀释倍数分别为10、20、30、50、100、150、200、250、300、400、500、1 000，测定不同农药浓度下酶的吸光度变化，计算酶抑制率。

1.2.5 大豆酯酶的固定及酶片和显色片的制作。

1.2.5.1 试验组①。

分别将硝酸纤维膜和滤纸剪成1 cm×1 cm的小片，放进0.03 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液中，4 ℃浸泡48 h。一次性取40 μL大豆酶液，30 μL 0.5%的BSA溶液，4 μL 0.05%戊二醛于平底试管中。添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液至总体积200 μL，将上述液体在漩涡混合器上混匀，取活化好的硝酸纤维膜浸入液体中，4 ℃下固定10 h。取出酶片，用pH 7.0的PBS溶液冲洗数次。4 ℃自然吹干或者用冷风吹干，封膜真空保存。

1.2.5.2 试验组②。

如图1，酶片制作流程：将滤纸剪成1 cm×1 cm大小的卡片，每片上加入20 μL酶液，20 μL底物α-乙酸奈酯丙酮溶液。

显色片制作流程（图1）：

显色片有2种方案，一种采用0.8%的固兰B溶液制作，另一种采用0.5%的2，6-二氯酚靛酚钠制作。显色片的制作，在1 cm×1 cm大小的滤纸片上加入50 μL显色剂，30 μL底物，4 ℃冷风吹干，封膜真空保存。

2 结果与分析

2.1 大豆酯酶原酶液活力测定

由表1可知，通过浸泡提取的原酶液活性较高，吸光度值达到0.844，说明大豆可以作为植物胆碱酯酶提取的试验材料。

2.2 最适反应温度

如图2可知，20～65 ℃下测定酶活力，大豆酯酶的最适反应温度在25～40 ℃，在30 ℃酶的活力最高。

2.3 最适pH测定

图3所示是在30 ℃温度下，在pH 4.5～8.5范围缓冲溶液中测定酶活力大小，大豆酯酶在pH 7.0～8.0范围内活性最高，其活力在pH 7.5时最高。

2.4 确定缓冲液的最适离子浓度

如图4所示，在0.010～0.045 mol/L不同离子浓度的缓冲溶液中测定酶活力，离子浓度在0.020～0.040 mol/L体系中大豆酯酶活力最大，其最大酶活力值在离子浓度为0.030 mol/L。

2.5 不同用量显色剂对酶活力的影响

由图5可知，当显色剂固兰B的用量不同时，溶液的吸光度值不一样，用量和吸光度值呈正相关，当将显色剂固定到白色滤纸载体上时，应使用较高用量，或者使用较高浓度，避免白色滤纸片对颜色的掩盖作用，使颜色分明，方便观察。

由表2可知，仅从酶的抑制率效果来看，使用2，6-二氯酚靛酚钠作显色剂，酶抑制率效果非常明显，平均抑制率326.07%，但試验发现，在不加酶的情况下，2，6-二氯酚靛酚钠依然褪色，从而得出结论，2，6-二氯酚靛酚钠不适合作有机磷农药残留快速检测的显色剂。使用固兰B作显色剂，检测酶抑制率效果相对较差，但是比较稳定。综合考虑，固兰B盐更适合作有机磷农药快速检测的显色剂。

2.6 氧乐果不同稀释浓度下对酶的抑制率

由表3可知，酶抑制率与农药浓度呈正相关，农药稀释浓度越大，酶抑制率越低，当稀释1 000倍时，酶抑制率还能达到10%左右。由此可见，氧乐果的药效较强。

2.7 比较2种显色片的效果

组合一见图6，固兰B、α-乙酸奈酯组合，将稀释一定浓度后的农药滴加到酶片上（图6中编号2、3），对照组滴加相同量蒸馏水（图6中编号1），保持酶片湿润，将显色片覆盖在酶片上，稍等片刻，编号1的酶片上没有农药，胆碱酯酶未受抑制，遇到显色剂，产生紫红色（由于色差，颜色更接近褐色）变化；编号2、3的酶片由于滴加了农药，胆碱酯酶受到抑制，显色片不变色。根据颜色变化和颜色深浅即可初步判断农药含量，农药含量越高，颜色越深，农药含量越低，颜色越浅。

组合二见图7，2，6-二氯酚靛酚钠做显色剂，将稀释一定浓度后的农药滴加到酶片上（图7中编号2、3），对照组滴加相同量蒸馏水（图7中编号1），保持酶片湿润，将显色片覆盖在酶片上，显色片立即产生变化，编号1的酶片上沒有农药，胆碱酯酶未受抑制，遇到显色剂，蓝色显色片不发生变化；编号2、3的酶片由于滴加了农药，显色片的蓝色立即褪色，数秒后蓝色全部褪去。

试验发现，在不添加酶的情况下滴加农药蓝色依然褪去，由此说明2，6-二氯酚靛酚钠不适合做有机磷农药残留快速检测的显色剂。

2.8 酶片测试结果 如图8所示，分别用稀释30倍（有效成分0.013 mg/kg）的氧乐果对固兰B酶片进行试验，观察显色效果，可看出依然能有效抑制酶活性，酶片不发生变化。试管抑制试验中，农药稀释1 000倍，抑制率依然达到10.3%。

3 结论

大豆酯酶作为一种廉价易得的植物酯酶，其最适反应温度为30 ℃，pH 7.5时酶的活性最高，缓冲液离子浓度在0.02～0.04 mol/L体系中大豆酯酶活力最大，其最大酶活力吸光度值为0.844。粗酶液在4 ℃和-20 ℃ 2个保藏温度下随着保藏天数的延长，酶活力均呈下降趋势，4 ℃保藏条件下的酶活力下降速度快于-20 ℃保藏条件，至保藏36 d时酶活力几乎完全丧失。

酶片采用硝酸纤维膜，制作每张酶片取20 μL大豆酶液，15 μL 0.5%的BSA溶液，2 μL 0.05%戊二醛于平底试管中，添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液至总体积100 μL，4 ℃固定10 h；制作每张显色片，需在1 cm×1 cm大小的滤纸片上加入50 μL显色剂，30 μL底物，4 ℃冷风吹干，封膜真空保存。

固兰B盐和α-乙酸奈酯组合，适合作为酶抑制法检测有机磷农药残留的显色剂，且效果明显。

参考文献

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