上海沿海地区蛭弧菌分离及其生长条件研究

程俊茗 尹清干 贾丹 袁海兰 董龙香 胡鲲 杨先乐

摘要：【目的】了解上海沿海地区蛭弧菌的分布状况及其生物学特性，为蛭弧菌在防治水产动物病害方面的应用提供参考依据。【方法】采用双层琼脂平板法对采自上海沿海地区不同水域环境中的蛭弧菌进行分离，利用16S rRNA进行鉴定，并对其裂解谱、盐度耐受性、弧菌裂解差异性和培养方式进行研究。【结果】从上海沿海地区共分离到12株蛭弧菌，其中3株（4.2、5.1和3N.3）对弧菌属具有很强的裂解性，但对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、脱氮副球菌、乳酸链球菌和保加利亚乳杆菌等有益菌无裂解作用。3株蛭弧菌在盐度1.5%～3.0%的范围内生长状况良好，5.1蛭弧菌株对溶藻弧菌的裂解能力较对副溶血弧菌和哈维氏弧菌的强，其差异达显著水平（P<0.05）。宿主菌灭活可有效提高蛭弧菌的生长速度及其浓度，在培养第60 h达峰值；蛭弧菌与宿主菌（大肠杆菌）经异步发酵后，蛭弧菌在培养第72 h达峰值。【结论】从上海沿海地区分离获得的蛭弧菌具有良好噬菌能力，对主要的海水致病菌和淡水致病菌均具有侵染裂解能力，对有益菌无杀灭效果，且具有广盐性特征，可用于蛭弧菌微生态制剂的研发。

关键词： 蛭弧菌；鉴定；裂解谱；盐度耐受性；裂解差异性；上海

中图分类号： S963.211 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0532-08

0 引言

【研究意义】蛭弧菌（Bdellovibrio）是一类以捕食细菌为生的革兰氏阴性细菌，广泛分布于淡水、污水、沉淀物、土壤和植物根际（Jurkevitch et al.，2000），因其可裂解大多数革兰氏阴性细菌和少数革兰氏阳性细菌，对水体中的致病菌具有裂解作用，为水产动物细菌病的生物防治提供了新途径（Fry and staples，1976；宋志萍等，2005）。此外，蛭弧菌基因组可编码多种有毒物质的抗阻蛋白，预示其有可能成为新型抗生素或消毒剂（蔡俊鹏和赵俊，2006）。蛭弧菌作为一种可裂解水体中致病菌的微生态制剂，能有效减少水产养殖动物细菌病的发病率，降低药物残留和细菌耐药性风险，最终促进水产养殖业的持续健康发展。【前人研究进展】蛭弧菌对致病菌的裂解作用使其具有巨大的潜在应用前景。黄冬菊等（2002）研究表明，蛭弧菌对海水弧菌具有良好的清除作用； Pineiro等（2004）对蛭弧菌的宿主范围进行研究，證实蛭弧菌对沙门氏菌属、志贺氏菌属、变形杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、弧菌属中的众多菌株具有很强的裂解能力；韩韫等（2005）通过研究蛭弧菌对弧菌的裂解效果，发现联合使用4株蛭弧菌的裂解率高达93.8%；张吕平等（2009）研究表明，运用噬菌蛭弧菌能有效预防对虾的弧菌病；储卫华等（2009）研究发现，蛭弧菌能清除副溶血弧菌，降低因副溶血弧菌感染引起的对虾死亡率，即蛭弧菌对对虾感染副溶血弧菌有明显的预防效果；黄亮等（2010）研究表明，蛭弧菌对牡蛎养殖水体和肠道中的副溶血弧菌具有清除作用；林阿乞等（2011）研究表明，将蛭弧菌应用到九孔鲍养殖中，其生长指标和存活率均有显著提高；Cao等（2012， 2015）研究发现蛭弧菌能够控制霍乱弧菌和气单胞菌；李丽等（2013）研究表明，纯化的蛭弧菌不仅能够裂解大肠杆菌、嗜水气单胞菌、弧菌等革兰氏阴性菌，还能够裂解无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌。【本研究切入点】虽然国内市场上已有生产和销售蛭弧菌制剂，但据温崇庆等（2009）对蛭弧菌制剂的检测结果显示，绝大多数产品根本不存在蛭弧菌。本课题组曾采用PCR和传统的平板法对26个蛭弧菌产品进行蛭弧菌分离，也均未分离到蛭弧菌。因此，有必要进一步探讨环境因素（盐度、宿主和发酵方式）对蛭弧菌生长的影响，为提高蛭弧菌制剂的性能提供参考。【拟解决的关键问题】采用双层琼脂平板法对上海沿海地区不同水域环境中的蛭弧菌进行分离，探究其裂解谱、盐度耐受性及弧菌裂解差异性，并采用液体培养法研究不同培养方式对蛭弧菌增菌效果的影响，优化其培养条件，以期为蛭弧菌在水产动物病害防治方面的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

宿主菌株共24株，分别为大肠杆菌21（Escherichia coli）、大肠杆菌AB90054、哈维氏弧菌V-1-3120（Vibrio harveyi）、哈维氏弧菌B0150、霍乱弧菌B0165（V. cho-

lerae）、溶藻弧菌1833（V. alginolyticus）、副溶血弧菌0394（V. parahemolyticus）、鳗弧菌Van-DC12R90387（V. anguillarum）、荧光假单胞菌ATCC10646（Pseudomonas fluorescens）、腐败假单胞菌0397（P. putrefaciens）、温和气单胞菌0398（Aeromonas sobria）、温和气单胞菌AB、嗜水气单胞菌1.927（A. hydrophila）、嗜水气单胞菌Sc-96-24、嗜水气单胞菌Ah9802120388、金黄色葡萄球菌B0125（Staphylococcus aureus）、乳酸链球菌X13（Streptococcus lactis）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、纳豆芽孢杆菌（B. natto）、脱氮副球菌ATCC-

19367（Paracoccus denitrificans）、酿酒酵母20034（Saccharomyces cerevisiae），均由国家水生动物病原库保存提供。细菌全基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，营养肉汤、琼脂购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器设备：扫描电子显微镜（S3400N II）、PCR仪（GT9612）、培养箱（MIR253）、离心机（CF16R）和恒温摇床[BSD-YX（F）3200]。

1. 2 样品采集

分别采集上海金山城市沙滩沿海（采样点1）的海水40 mL及表层底泥20 g、上海崇明岛富民农场沿海（采样点2）的海水40 mL及表层底泥20 g、上海芦潮港沿海（采样点3）的海水40 mL和上海炮台湿地公园沿海（采样点4）的海水40 mL及表层底泥20 g，样品采集后冷藏（0～6 ℃）运回实验室。将水样和底泥（以无菌海水稀释）放入50 mL的离心管中，2000 r/min离心15 min，取上清液，4 ℃保存备用。采样站位分布如图1所示。

1. 3 蛭弧菌分离纯化与鉴定

采用双层琼脂平板培养法对处理过的水样和泥样进行蛭弧菌分离，根据出斑时间及噬菌斑形状纯化蛭弧菌，采用钱天乐等（2009）的方法对蛭弧菌进行电镜观察前处理；参照Marchesi等（1998）和Jurkevitch等（2000）的方法设计特异性引物，再以通用引物（5'-

CAGGCCTAACACATGCAACTC-3'）为上游引物、特异引物Bdg842R（5'-CGWCACTGAAGGGGTCAA-3'）

为下游引物进行PCR扩增。PCR反应体系50.000 μL，其中，10×PCR Buffer（含1.5 mmol/L Mg2+）7.500 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.400 μL，Taq酶（2 U/μL）0.625 μL，上、下游引物各2.000 μL，DNA模板（10 ng/μL）5.000 μL，用DEPC处理水补足至50.000 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行32个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳，产物送至上海迈浦生物科技有限公司测序，测序结果在GenBank中进行BLAST分析，并构建系统发育进化树。

1. 4 蛭弧菌裂解谱分析

选取24株宿主菌株，采用双层琼脂平板培养法对3株蛭弧菌进行裂解谱分析。双层琼脂平板培养基下层为1.2%琼脂（20 mL）、上层为0.8%琼脂（10 mL），上层培养基加入3×1011 CFU/mL宿主菌悬液1 mL。宿主菌悬液的制备：用营养肉汤培养宿主菌株24 h，然后4500 r/min离心15 min，用0.85%生理盐水洗涤菌体沉淀3次，最后将菌悬液浓度调至3×1011 CFU/mL，4 ℃冷藏备用。

1. 5 蛭弧菌盐度耐受性分析

采用双层琼脂平板培养法，将蛭弧菌置于不同盐度（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%）下培养，根据形成噬菌斑数量判断蛭弧菌对盐度的耐受性，并测定最佳生长盐度。

1. 6 蛭弧菌裂解差异性分析

选用不同宿主菌（溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和大肠杆菌）对蛭弧菌株进行平板计数，以大肠杆菌为参照，根据形成的噬菌斑数量判断蛭弧菌对宿主菌侵染裂解作用。噬菌斑形成数量越多，表明蛭弧菌对某一宿主的侵染裂解效率越强。

1. 7 培养方法对蛭弧菌生长的影响

1. 7. 1 宿主菌灭活对蛭弧菌发酵的影响 宿主菌灭活培养法：制备好的大肠杆菌悬液90 ℃水浴灭活30 mim，灭活后的大肠杆菌悬液用无菌生理盐水稀释至3×108 CFU/mL。将蛭弧菌以5%的接种量接入大肠杆菌悬液中，28 ℃下摇床（140 r/min）培养，每隔12 h对蛭弧菌的生长情况进行观察记录，直至96 h结束。宿主菌不灭活培养法：将新鲜的大肠杆菌悬液用无菌生理盐水稀释至3×108 CFU/mL，除不进行灭活处理外，其他处理同宿主菌灭活培养法。

1. 7. 2 发酵方式对蛭弧菌生长的影响 营养肉汤同步发酵培养法：将大肠杆菌菌液和蛭弧菌液均以5%的接種量同时接入无菌营养肉汤，28 ℃下摇床（140 r/min）培养。营养肉汤异步发酵培养法：将大肠杆菌先接入营养肉汤培养至3×108 CFU/mL后，再以5%的接种量将蛭弧菌液接入大肠杆菌悬液中，28 ℃下摇床（140 r/min）培养。

2 结果与分析

2. 1 蛭弧菌的分离鉴定结果

从4个采样点的水样和泥样中共分离获得12株分离菌株，分别命名为5.1、4.2、3N.3、L5.3、C7.2、Y4.1、X1.1、Y4.5、L6.1、8.5、8.1和6.3。经PCR扩增其16S rRNA序列，结果发现12株分离菌株均在800 bp附近出现清晰的单一条带（图2），与预期结果相符。测序结果在GenBank中进行BLAST分析并构建系统发育进化树（图3），结果显示，12株蛭弧菌均与Bdellovibrio聚为一支。因此证实12株分离菌株均为蛭弧菌。

蛭弧菌在双层琼脂培养基上形成的噬菌斑具有多样性（图4），与大肠杆菌共培养60 h后可观察到清晰的噬菌斑。不同蛭弧菌形成的噬菌斑略有不同，主要表现为凹陷程度和透明斑大小，如5.1蛭弧菌株的噬菌斑形态为深入凹陷且透明，4.2蛭弧菌株的噬菌斑形态透明但不凹陷，8.1蛭弧菌株的噬菌斑非常小、透明、不凹陷。经扫描电镜观察发现，蛭弧菌呈圆杆状，具有端生单根鞭毛，菌体大小0.65 μm×0.30 μm，鞭毛长2.00 μm（图5）。

2. 2 分离蛭弧菌的裂解谱

从12株蛭弧菌中选取3株（4.2、5.1和3N.3）进行裂解试验，结果表明，3株蛭弧菌对所有宿主弧菌（哈维氏弧菌V-1-3120、哈维氏弧菌B0150、霍乱弧菌B0165、溶藻弧菌1833、副溶血弧菌0394和鳗弧菌Van-DC12R90387）均具有良好的裂解能力，但对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、脱氮副球菌、乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌等有益菌没有裂解作用（表1）。其中，5.1蛭弧菌株对致病菌具有良好的裂解能力，除了能裂解弧菌外，对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和腐败假单胞菌也有裂解作用，是一株裂解谱较广的优良蛭弧菌株。

2. 3 蛭弧菌盐度耐受性分析结果

由图6可看出，3株蛭弧菌在盐度1.5%～3.0%的范围内生长状况良好。其中，5.1蛭弧菌株对盐度的耐受范围是0.5%～4.0%，最适生长盐度2.5%；4.2蛭弧菌株对低盐度具有较好的耐受性，最适生长盐度1.5%；3N.3蛭弧菌株具有较强的耐盐能力，在盐度为4.5%时依然能生长，是一株广盐性菌株。

2. 4 蛭弧菌裂解差异性分析结果

以5.1蛭弧菌株为代表，分析溶藻弧菌1833、副溶血弧菌0394、哈维氏弧菌V-1-3120和大肠杆菌AB90054等宿主菌对蛭弧菌生长的影响，结果（图7）表明，5.1蛭弧菌株在以溶藻弧菌1833为宿主菌的双层琼脂培养基上能够形成大量噬菌斑，与副溶血弧菌0394、哈维氏弧菌V-1-3120和大肠杆菌AB90054相比，存在显著差异（P<0.05），表明5.1蛭弧菌株对溶藻弧菌的侵染效果强于副溶血弧菌、哈维氏弧菌和大肠杆菌。

2. 5 培养方法对蛭弧菌增菌效果的影响

由图8可看出，宿主菌（大肠杆菌）经灭活后，蛭弧菌在培养第60 h达峰值，相对于其他3种方法，营养肉汤灭活宿主菌法达峰值时间最短。宿主菌未经灭活处理而直接与蛭弧菌同步发酵培养，蛭弧菌达峰时间延迟，但浓度并未快速下降。其原因可能是将宿主菌灭活后其细胞壁结构遭到破坏，减少蛭弧菌进入宿主菌的阻力，达到快速进入宿主的目的，导致蛭弧菌快速增殖；到培养后期，其他3个处理组的宿主菌形态结构和活力变化不明显，而灭活处理组中由于未被侵染的宿主菌发生自溶，失去原有结构，致使蛭弧菌下降最迅速。

3 讨论

弧菌病在鱼、虾、蟹及贝类等水产动物中发病率高，是一类危害最严重的细菌性疾病，给水产养殖业造成巨大经济损失（李亚晨等，2004；杨少丽等，2005）。本研究从上海沿海地区分离获得12株蛭弧菌，有3株（4.2、5.1和3N.3）对5种弧菌具有良好的裂解能力，且表现为对溶藻弧菌的裂解能力较对副溶血弧菌和哈维氏弧菌的强，但对芽孢杆菌、脱氮副球菌、乳酸菌等有益菌无裂解作用。其中，5.1蛭弧菌株对致病菌具有良好的裂解能力，除了能裂解5种弧菌外，对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和腐败假单胞菌也具有裂解作用，是一株裂解谱较广的优良蛭弧菌株。Taylor等（1974）研究表明，从海水分离获得的蛭弧菌对大多数海洋细菌及陆生细菌均有裂解能力，但对少数陆生菌株的裂解效率较低。Takubo等（1989）研究认为，裂解差异可能与宿主表面结构及蛭弧菌的识别系统差异有关。此外，蛭弧菌盐度耐受性分析结果表明，5.1蛭弧菌株（分离自上海芦潮港水样）具有广盐性特征，可能是采样點受海水与淡水相互作用而导致菌株的广盐性；3N.3蛭弧菌株分离自上海炮台湿地公园的水样，因采样点地处海水侵蚀区域导致其对盐度耐受性较强；4.2蛭弧菌株对盐度的耐受性不及上述的2株蛭弧菌株。可见，蛭弧菌能够适应盐度变化，且对大多数致病菌具有裂解作用，能达到净化水质、消除致病菌和防治细菌性疾病等多重目的。

为优化蛭弧菌的培养条件，本研究采用液体培养法探讨不同培养方式对蛭弧菌增菌效果的影响，结果发现宿主菌（大肠杆菌）灭活处理后，蛭弧菌在培养第60 h达峰值，相对于其他3种方法，该方法的达峰时间最短；宿主菌不灭活组的蛭弧菌在培养第72 h达峰值，相对于宿主菌灭活组的达峰时间延迟，且蛭弧菌浓度相对较低。Shemesh和Jurkevitch（2004）研究认为，蛭弧菌裂解大多数革兰氏阴性宿主细菌后，残余的宿主细胞对蛭弧菌具有耐受性。即灭活宿主菌失去对蛭弧菌的耐受性，有助于蛭弧菌生长，使得蛭弧菌滴度提高且峰浓度提前；而未灭活宿主菌对蛭弧菌的侵染产生耐受性，阻碍其生长。此外，在同步发酵和异步发酵中，残余的大肠杆菌对蛭弧菌可能会产生耐受性。Varon和Zeigler（1978）曾研究认为，蛭弧菌和宿主菌的比例需达1∶250时蛭弧菌才可以捕食；Frataminco和Whiting（1995）报道宿主菌与蛭弧菌比例为10∶1是蛭弧菌裂解宿主的最佳条件。本研究的同步发酵处理在迟缓期（培养第12 h）呈下降趋势，可能是初始接种的宿主菌量未达上述比例要求，无法供蛭弧菌正常生长而导致其死亡。

一般情况下，蛭弧菌生长较缓慢，至少需要培养48 h才能形成肉眼可见的噬菌斑，且许多蛭弧菌属于非可培养细菌（李祎等，2013）。随着分子生物技术的快速发展，快速检测蛭弧菌的方法不断优化，但针对其活体的检测只有平板培养法。康颖倩等（2014）、温崇庆等（2015）分别采用16S rRNA基因扩增和构建克隆文库对水体中的蛭弧菌进行检测，结果分离出高度多样的蛭弧菌；薛明等（2014）研究发现，在分离计数海洋蛭弧菌及其多样性检测时采用海水培养基的效果优于聚蛋白胨培养基。目前，只有极少数的近海海洋微生物能通过传统固体培养基培养获得菌落，而绝大多数能在显微镜下观察到的环境微生物都不能在传统固体培养基上形成可见菌落（Eilers et al.，2000；Rappe and Giovannoni，2003）。可见，蛭弧菌的培养获得仍是其优势种筛选及研究的瓶颈。加之蛭弧菌在保存过程中极易死亡，即使综合运用甘油和液氮进行尝试（田双娥和蔡俊鹏，2014）也未能获得良好的效果，因此今后需要进一步优化蛭弧菌的培养及保藏方法。

4 结论

从上海沿海地区分离获得的蛭弧菌具有良好噬菌能力，对主要的海水致病菌和淡水致病菌均具有侵染裂解能力，对有益菌无杀灭效果，且具有广盐性特征，可用于蛭弧菌微生态制剂的研发。

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（責任编辑 兰宗宝）