云南蚕区家蚕品种资源对家蚕核型多角体病毒的抗性评价分析

邵榆岚 唐芬芬 张一川 张永红 朱峰 白兴荣

摘要：【目的】全面掌握云南蚕区家蚕品种资源的抗家蚕核型多角体病毒（BmNPV）能力，为挖掘具有特色的家蚕抗病材料及培育适应当地的抗病品种提供参考。【方法】采用三龄起蚕经口添食相同浓度病毒、逐日调查存活率的方法，对200个家蚕品种（品系）进行BmNPV抗性评价和筛选；并通过接种后每日存活数、各发育时期存活率等指标分析云南蚕区家蚕品种资源对BmNPV的抗性水平、发病死亡规律、不同抗性品种的发病死亡时期及同一品种不同品系间抗性差异。【结果】云南蚕区家蚕品种资源中抗BmNPV的品种有731、795、854B、872A、966B、B黄肉色茧、P50、山河B、选二甲白和竹印，感病品种包括955、242A、242B、963B、DW3、锦秀A、锦秀B、日、野乙和云夏A油。各抗病品种和感病品种首次出现死亡差异的时间截点分别是接种后96 和48 h，二者相差48 h；部分抗病品种在秋季对BmNPV的抗性水平低于春季；同一家蚕品种A系和B系的抗病性差异不显著（P>0.05）。【结论】云南蚕区家蚕品种资源中大多数品种的抗BmNPV能力属于中等水平，其中P50为BmNPV抗性最强品种。对未知品种进行抗BmNPV测定时，可选择接种后168 h作为抗性评价的时间截点。

关键词： 家蚕品种；核型多角体病毒（BmNPV）；抗性评价；云南蚕区

中图分类号： S884.51 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0517-07

0 引言

【研究意义】家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）隶属于杆状病毒科（Baculoviridae），为双链DNA病毒，其感染家蚕后的典型病症是家蚕体躯肿胀且呈乳白色，与其他家蚕病毒病存在明显区别，能够通过肉眼判断。据家蚕流行病学调查发现，BmNPV是云南蚕区发生较广且危害严重的主要病原（白兴荣等，2010），生产上多于三龄后发病，一旦发病即迅速蔓延，目前尚无直接有效的治疗药物，消毒预防、抗病育种仍是主要的防病措施。因此，全面掌握云南蚕区家蚕品种资源的抗BmNPV能力，对促进云南桑蠶产业持续发展具有重要意义。【前人研究进展】家蚕核型多角体病毒病的发生主要与家蚕自身抗性、饲养环境和病毒侵染力等有关（唐芬芬等，2015），且有研究证实，不同家蚕品种对BmNPV存在品种间、系统间及化性间的抗性差异（陈克平等，1991；朱勇等，1998）。钱荷英等（2006）研究表明，家蚕对BmNPV经口感染的抵抗性遗传方式受一对主效基因和若干微效基因控制。吴福泉等（2010）研究发现，通过对家蚕累代添食BmNPV可提高其抵抗能力，且经济性状稳定。对于家蚕品种（品系）的抗BmNPV筛选，无论是抗病育种还是抗病基因挖掘均具有重要意义。刘晓勇等（2004）在高抗材料和敏感材料的基础上，采用RAPD筛选获得抗BmNPV的相关分子标记（GenBank登录号AY380833）；徐安英等（2013）以含Bm-

NPV耐受基因的品种为母本，培育获得高抗BmNPV的新品种——华康2号。但目前有关家蚕抗BmNPV品种的测定尚无统一标准可参考，主要是由于人工接种方法和时间、评定指标、统计时间等不同而呈现不同结果（陈克平等，1991；朱勇等，1998；钱荷英等，2006）。其中，评定家蚕抗病性的指标有发病率、健蛹率、潜育期、半数致死期和半数致死剂量等（林昌麒，1987；陈义安等，2016）；人工接种方法主要是在各龄起蚕时皮下注射或经口添食，而经口添食又分为直接家蚕口器滴喂法和桑叶病毒液浸渍法或涂抹法；统计时间方面，为防止二次感染，通常在接种后3或4 d统计发病情况。【本研究切入点】随着云南蚕区家蚕品种资源的收集和引进，发现其在当地与原产地的抗病性试验成绩存在明显差异，可能与云南的自然气候条件有关，但具体原因有待进一步研究证实。【拟解决的关键问题】对云南蚕区保存的200个二化性家蚕资源品种（品系）进行BmNPV抗性测定，全面掌握云南蚕区家蚕品种资源的抗BmNPV能力，为挖掘具有特色的家蚕抗病材料及培育适应当地的抗病品种提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试家蚕品种（品系）均由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所家蚕资源保存研究室提供，均为二化性品种，其中日系品种110个、中系品种90个。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 BmNPV多角体准备 实验室扩繁BmNPV，采用家蚕普种菁松×皓月，接种后于五龄出现全身发白、肿胀时收集发病蚕，经3 d自然腐败后4 ℃保存备用。取适量发病蚕尸体置于研钵中研磨，组织液用夹带薄层棉花的3层纱布过滤2次，收集滤液。滤液用灭菌水稀释，然后进行差速离心。首先采用500 r/min离心5 min，弃沉淀取上清液，6000 r/min离心20 min，取出沉淀中的白色部分，其余沉淀加灭菌水混合振荡后再进行高速离心，反复高速离心并收集白色沉淀部分，用灭菌水悬浮，呈灰白色，含大量病毒多角体。随后降低离心速度和时间，5000 r/min离心10 min以除去沉淀外层灰褐色部分，多次重复，待显微镜观察细菌含量极少时收集沉淀，用少量灭菌水悬浮，呈纯白色，得到的高纯高浓度病毒多角体液4 ℃保存。使用当天取适量病毒多角体液用灭菌水稀释，采用血球计数板测定浓度，制备所需浓度的BmNPV多角体液。

1. 2. 2 家蚕品种对BmNPV抗性的初步筛选 供试家蚕品种（品系）于春季分两批养蚕至三龄起，当天采摘适龄新鲜桑叶，清洗晾干后选择无皱桑叶，用直径7 cm的打孔器制成大小一致的圆形叶，以1×107个/mL的BmNPV多角体液浸渍桑叶，待桑叶表面水分蒸发后，以等量桑叶给三龄起蚕经口接种。每个品种（品系）每个重复90头健康蚕，置于带盖塑料盒中饲养（每盒12片带毒桑叶），2次重复。接种期防止桑叶凋萎，保证食尽桑叶，第2餐开始更换普通新鲜桑叶。从第2 d开始逐日调查发病死亡数。为防止二次感染，上午喂蚕前去除残叶蚕沙，更换垫纸和塑料盒，下午喂蚕前用新鲜石灰粉进行蚕体、蚕座消毒。每天喂蚕结束后用含1%有效氯的漂白粉水进行蚕室地面消毒。

1. 2. 3 部分家蚕品种对BmNPV抗性的二次筛选 根据春季全面筛选结果，选取存活率较高的家蚕常规品种（品系）和彩色茧品种于秋季进行二次筛选。添毒浓度和方法、调查方法、消毒方法与第1次筛选相同。每个品种（品系）每个重复30头健康蚕，每盒4片带毒桑叶，3次重复。

1. 3 统计分析

第1次筛选各品种（品系）存活率、死亡数和第2次筛选部分品种（品系）春秋两季存活率、彩色茧品种的抗性筛选数据采用Excel 2007统计及制作图表，同一品种A系和B系品种的抗性比较采用SPSS 19.0进行独立样本t 检验。

2 结果与分析

2. 1 200个家蚕品种（品系）对BmNPV抗性的调查结果

三龄起各家蚕品种（品系）添食病毒的发育时期与相应接种后时数如表1所示。三龄起蚕接种BmNPV后逐日调查存活率，结果发现接种48 h后有16个品种的死亡数超过2/3，即存活率不到30%；接种后96 h（四龄起），多数品种出现大批量死亡，35%品种（70个）的存活率在80%以上，13%品种（26个）的存活率低于40%，52%品种（104个）的存活率在40%～79%；随着日龄的增长，接种后240 h（五龄起），有2个品种存活率高于80%，78%品种（156个）的存活率低于40%，其中4个品种全部死亡；至上簇时，有26个品种结茧化蛹。由图1可知，存活率在40%～59%的品种占有率在各时期分布较均衡，80%以上存活率的品种在前期占有率较高，但后期几乎不存在高存活率的品种。

当BmNPV接种浓度为1×107个/mL时，云南蚕区家蚕抗BmNPV能力整体属于中等水平，特别是常规品种中未发现高抗品种。于三龄起蚕接种BmNPV后，少数品种在感染早期死亡明显，四龄后存活数极少，如242B和2002A等；部分品种除在三眠期前后及四眠期前后死亡数少量上升外，其他时间死亡数较少，如新松B和浙蕾乙等；部分品种三龄、四龄期死亡数较少，五龄后死亡数明显增加，如山11和苏镇A等；部分品种只有在四龄起蚕时死亡数增加，其他时间死亡量较少，如竹岭A和选二甲花等。

调查还发现，三龄起蚕接种BmNPV后，许多品种在眠前眠后2个时段出现死亡数量明显增加现象。对同批次114个品种（品系）每日死亡数据进行分析，如图2所示，每条曲线代表1个品种（品系），在三龄第4 d和四龄第1 d、四龄第5 d和五龄第1 d的死亡数量出现高峰，到四龄第2 d、五龄第2 d死亡数量急速回落，因此推测家蚕在龄期末和龄期初存在某种机制导致家蚕的抵抗力下降，从而导致该时段的死亡数量骤增。在接种BmNPV后2个眠期出现死亡高峰，且其他时间死亡较少，说明本研究的人工接种方法有效，未出现感染后期因蚕座感染（二次感染）导致死亡数量直线上升的现象。

2. 2 200个家蚕品种春季接种相同BmNPV后抗病品种和感病品种的选择

根据200个家蚕品种接种BmNPV后的逐日死亡数据可知，不同品种的大量发病死亡时期存在明显差异，无法在某个时间点选择高存活率品種作为抗病品种。为筛选获得抗病品种和感病品种，整理出接种后四龄起到五龄第5 d期间各家蚕品种存活率前5名和后5名的排名，排名出现3次以上的品种暂归属于抗病品种或感病品种。由表2可知，在10个抗病品种中中系品种占60%、日系品种占40%，其中B黄肉色茧和P50为彩色茧品种，且存活率排名较前；在10个感病品种中中系品种占30%、日系品种占70%，其中野乙含野蚕血统。图2显示接种BmNPV后第2～3 d死亡数量最多的品种均属于表2中的感病品种，说明感病品种在感染BmNPV早期，未经过眠期时即可与其他品种区分。

2. 3 不同家蚕品种接种相同浓度BmNPV后评价时间的选择

三龄起蚕接种BmNPV后的前3 d，大多数家蚕品种死亡数较少，不同品种间差异不明显；但感染后期，经历2次眠期的家蚕累积死亡数大幅度增加。随机选取4组家蚕（A、B、C和D），每组10个品种，逐一编号，共40个未知抗性水平的品种，分析其接种后96～288 h的累积存活数。如图3所示，每条曲线代表1个品种。病毒接种96 h，经过第1次眠期，不同品种的存活数（起始点）开始出现差异，但部分品种仍然具有相同的起始点，说明这部分品种在接种96 h时还无法区别抗性差异；至接种168 h后，存活数出现明显下降，且不同品种的存活数明显不同（无重叠点）；在接种168～192 h时，不同品种的存活线路交错明显，至接种192 h（四龄眠前1 d），大多数品种的存活数降至低值。经过第2次眠期，至接种240 h（五龄起）时各品种的存活数第2次下降到低值，此后其存活数下降缓慢。根据半致死时间分析结果可知，在接种168 h时各家蚕品种的存活率平均在50.00%左右。可见，对未知家蚕品种进行BmNPV抗性测定时，选择接种后168 h作为抗性评价的时间截点可区别大多数品种的抗性差异。

比较抗病品种和感病品种（表2）接种BmNPV后6～288 h的存活数，分析抗感品种发病死亡的时间。由图4可看出，接种BmNPV后6～288 h抗病品种和感病品种存活头数存在明显差异。抗病品种的存活数在接种后72～96 h出现小幅度下降，且在接种96 h时具有明显不同（无重叠点），接种192 h后再次出现明显下降趋势，至接种240 h时各抗病品种的存活数差异明显。感病品种接种后前3 d的存活数下降趋势明显较抗病品种快，在接种48 h时各感病品种的存活数第1次出现不同，至接种96 h时各感病品种的存活数差异明显，其平均存活率为19.50%，此时抗病品种的平均存活率为87.83%，二者相差约4.5倍。各抗病品种和感病品种首次出现死亡差异的时间截点分别是接种后96和48 h，相差48 h。从半致死时间来看，抗病品种约在接种后288 h，感病品种约在接种后72 h，相差216 h。因此，在筛选不同抗性水平的家蚕品种时应根据其发病时间规律，选取相应的评价截止时间。

2. 4 A系和B系品种的抗性比较结果

通过筛选可知，云南蚕区家蚕保存资源种中存在许多含有A系、B系的品种，选择20个同名品种于接种后168 h对平均存活率进行比较。如图5所示，品种1、2、9、15、16、19、20的A系、B系存活率相近，品种3、4、8、12、14的A系存活率明显高于B系，品种5、6、7、10、11、13、17、18的A系存活率低于B系。为更好获知A系与B系品种的抗性差异，在所有40个品系中进行A系和B系的独立样本t 检验，结果显示，A系和B系两个品系接种BmNPV后168 h的存活率平均值差异不显著（P>0.05）。

2. 5 抗性较好家蚕品种秋季二次筛选结果

根据春季筛选及抗病性评价时间的分析结果，选择接种后96和240 h（2次眠起后第1 d）作为评价时间的截点，其存活率如表3所示。接种BmNPV后96 h，854B、872A、P50和山11等品种在春秋两季的存活率均较高；795、966B、选二甲白和云7B等品种在秋季的存活率明显低于春季；731、B黄肉色茧、E优白、竹印和云8B等品种的春季存活率较高，秋季存活率在50.00%以上；此时的山河B抗病能力在春秋两季不突出，较稳定，但明显强于感病品种对照（242B）。接种BmNPV后240 h，大多数品种的秋季存活率明显低于春季，且以P50、山11和竹印等品种的秋季存活率较高。

2. 6 彩色茧品种的抗性二次筛选结果

根据第1次抗性筛选结果（表2）可知，10个抗病品种中有2个彩色茧品种（B黄肉色茧和P50），且按存活率排名位于前列。为此，在二次筛选时选择云南蚕区所有彩色茧品种（15个）再次进行抗性筛选，其中四眠、日系、黄色茧品种5个，四眠、中系、黄色茧品种4个，四眠、中系、绿色茧品种2个，四眠、日系、绿色茧品种1个，三眠、日系、红色茧品种1个，三眠、中系、红色茧品种2个。抗性筛选结果显示，除B黄肉色茧和P50抗性较好外，4号和E黄1等品种的存活率也较高。

3 讨论

为获得抗BmNPV的家蚕品种，本研究采用三龄起蚕添食相同高浓度病毒的方法对200个家蚕品种（品系）的抗BmNPV能力进行测定，从三龄起蚕攻毒后饲养至上簇结茧，旨在全面考察各家蚕品种三龄至五龄期的抗BmNPV能力。在本研究中，因参试品种数量较多，试验周期较长，为降低试验强度又提高试验准确度，故采用全部品种添食同一高浓度病毒的方法，结果发现感病品种在接种24 h后开始出现死亡，显微镜镜检能观察到BmNPV，能明显区分出感病品种，且在接种BmNPV后2个眠期出现死亡高峰，但未出现感染后期死亡数量直线上升的现象。此外，本研究发现一些家蚕品种前期发病死亡较少，到后期发病死亡数却较多；一些品种前期死亡较多，但后期存活数较多，可能是部分品种侵染抵抗性较强，而有的品种扩展抵抗性较强。以此为据，整理接种后四龄起到五龄第5 d期间各家蚕品种存活率前5名和后5名的排名，排名出现3次以上的品种归属于抗病品种或感病品种，最终初步筛选出云南家蚕资源保存种中对BmNPV抗病的品种，包括731、795、854B、872A、966B、B黄肉色茧、P50、山河B、选二甲白和竹印。

通过分析家蚕品種（品系）的发病死亡时间规律，而获得不同抗性水平品种（品系）评价的最佳时间截点，是抗性选择的一个重要研究方面，其主要内容包括未知抗性水平品种（品系）的评价时间及抗病/感病品种的评价时间。本研究从200个家蚕品种中随机抽取4组家蚕（A、B、C和D），共40个品种，分析其接种BmNPV后96～240 h期间每24 h的存活数曲线，结果表明，在接种后168 h时各曲线重叠最少，能够区分各品种的抗性水平，且此时致死数量平均为50%，此结果可为未知抗性水平品种（品系）BmNPV感染相关研究的评价截止时间提供参考。通过比较抗病品种和感病品种接种BmNPV后24～240 h的死亡时间规律，得知二者首次发病死亡时间分别为接种后96和48 h，半数致死时间为接种后288和72 h，说明云南蚕区家蚕抗病品种和感病品种的差异明显。云南蚕区家蚕品种资源中有许多品种有A系和B系，本研究选择20个家蚕品种的A系和B系同时进行BmNPV抗性测定，结果显示，虽然具体某一品种的A系存活率与B系存活率可能有所不同，但差异均未达显著水平，表明同一品种A系和B系的抗病性不存在遗传差异。

本研究发现许多家蚕品种在眠前后的存活数差异明显，推测家蚕的生理状态在这两个时段发生明显变化，使得家蚕自身抗性下降。郭锡杰等（1996）在研究微孢子虫对家蚕肠液中蛋白酶和碱性磷酸酶活力的影响时，发现这两种酶在起蚕和将眠时的活力明显降低，但食桑后又逐渐增强。陈文柱等（2005）研究表明，家蚕血淋巴中酚氧化酶活力在龄末和龄初比较低，龄中比较高。调节昆虫生长发育及变态的激素能影响病毒感染进程（谢洪霞，2010）。家蚕眠期主要受到激素控制，激素的分泌是否是影响此时家蚕存活率的重要因素，尚有待进一步探究。从家蚕病理学角度来看，鉴定家蚕品种（品系）的抗病能力是获取抗病素材最基础的工作，从中掌握各种品种（品系）的发病规律能为今后的家蚕病理研究提供参考。但目前家蚕品种抗病评价常因家蚕接种时间较长、操作不精细、易造成二次感染等原因而影响试验的重复性，因此，家蚕抗性评价的方法有待进一步优化。

4 结论

云南蚕区家蚕品种资源中大多数品种的抗BmNPV能力属于中等水平，其中P50为BmNPV抗性最强品种。对未知品种进行抗BmNPV测定时，可选择接种后168 h作为抗性评价的时间截点。

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（责任编辑 兰宗宝）