不同氮磷钾营养水平对铁皮石斛组培苗生长的影响

罗剑飘 谭嘉娜 杨俊贤 官锦燕 黄海英 罗青文 谢静 陈月桂

摘要：【目的】分析不同氮、磷和钾营养水平对铁皮石斛组培苗生长的影响，为其组培快繁及田间施肥管理提供参考依据。【方法】以铁皮石斛壮苗阶段的组培苗为材料，采用L9（33）正交设计研究培养基中氮、磷和钾三大元素含量配比对其株高、叶片数、新增根数、分蘖数和相对增重率的影响，并对其中影响显著的钾元素进行单因素多水平影响试验。【结果】极差分析结果显示，氮对铁皮石斛组培苗株高和分蘖数影响最大，钾对新增根数和相对增重率影响最大，磷对叶片数影响最大。方差分析结果表明，氮、磷和钾对铁皮石斛组培苗的叶片数及新增根数均无显著影响（P>0.05）；氮对株高和分蘖数影响明显，以N2水平（氮30.0 mmol/L）的株高最高，N3水平（氮60.0 mmol/L）的分蘖数最多；钾对铁皮石斛组培苗相对增重率影响显著（P<0.05），以K3水平（钾20.0 mmol/L）的相对增重率最高。钾离子含量试验结果表明，在一定范围内，随着钾离子浓度的增加，组培苗的相对增重率呈上升趋势，以处理k5（钾40.0 mmol/L）组培苗的相对增重率最高。【结论】在铁皮石斛组培苗增殖阶段，培养基中最佳氮、磷和钾含量配比分别为60.0、1.2和20.0 mmol/L，在壮苗阶段，培养基中最佳氮、磷和钾含量配比分别为30.0、1.2和20.0 mmol/L。在铁皮石斛组培苗生产过程中，可在此含量配比基础上添加激素及其他有机或无机营养组分，以促进组培苗生长。

关键词： 铁皮石斛；培养基；氮；磷；钾；正交试验；组织培养

中图分类号： S682.31 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0481-07

0 引言

【研究意义】铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属多年生草本植物，分布于安徽、浙江、福建、广西、四川及云南等地海拔800～1500 m山地覆有苔藓或腐殖质的岩石或树干上（李娟等，2011），富含多糖、生物碱、氨基酸及矿物质等多种有益于人体健康的药用活性成分，具有益胃生津、滋阴清热、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力等功效（中华人民共和国药典委员会，2010；蔡光先等，2011；李娟等，2011；谭丹等，2016），为我国特有的传统名贵中药材。目前铁皮石斛野生资源已濒临绝迹（Chen et al.，2012），被列为国家重点保护药用植物、中国珍稀濒危Ⅱ级保护植物和世界二类保护植物。因此，通过组织培养快速繁育铁皮石斛种苗对其资源保护及可持续利用具有重要意义。【前人研究进展】近年来，国内外通过组培方式对铁皮石斛进行保护和生产取得了较大进展，同时也遇到一些技术瓶颈，如培养基中添加香蕉、土豆和椰汁等有机物有助于提高铁皮石斛种苗的分化率或促进种苗生长（蒋林等，2003；周俊辉等，2005；宋顺等，2013），但存在培养基配制繁琐、生产成本高等问题；铁皮石斛所采用的基本培养基多为前人常用的固定配方MS、3/4MS、1/2MS、B5和N6等（周俊辉等，2005；Lin et al.，2011；吴菊等，2014；Fu et al.，2014；Teixeira et al.，2015），缺乏对其组培阶段大量元素需求的精细化研究数据；采用不同种类和浓度的激素有助于提高铁皮石斛不定芽和丛生芽分化率，但随着激素浓度的增加，铁皮石斛生长受到抑制，并容易出现卷叶、矮化、无根或少根等畸变现象，甚至枯萎死亡（郭洪波等，2007；李莹等，2012）。罗昌国等（2010）、Wang等（2011）、黄科等（2014）、邝雷等（2014）、Jungers等（2015）研究表明，适宜的氮、磷和钾营养配比可提高苗木质量、缩短苗木生产周期，有利于农作物生长、产量和品质提高。【本研究切入点】目前，针对培养基中氮、磷和钾营养配比对铁皮石斛组培苗生长影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以铁皮石斛组培幼苗为材料，采用正交设计研究不同氮、磷和钾用量及配比对其组培苗生长的影响，为完善其组培快繁技术及提高田间施肥管理水平提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料及培养条件

供试铁皮石斛组培苗由广东省生物工程研究所湛江甘蔗研究中心提供。选取处于壮苗阶段、生长良好、长势均一、高约2 cm的铁皮石斛幼苗，切割成单株接种。

培养条件：温度（25±2）℃，光照强度1500～2000 lx。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 氮、磷和钾含量配比正交试验 参照王春等（2007）的方法，以1/2MS培养基（MS培养基中大量元素减半，其他成分不变。下同）为基础，以氮、磷和钾浓度为变量，设3因素3水平，采用L9（33）正交设计（表1），按照表2的配方配制大量元素溶液。其中氮水平30.0 mmol/L、磷水平0.6 mmol/L及钾水平10.0 mmol/L分别与1/2MS培养基中的氮、磷和钾元素含量接近。每瓶培养基中接种观察5株铁皮石斛组培苗，4次重复，接种90 d后测定各处理组合植株的株高、叶片数、新增根数、分蘖数及相对增重率。

相对增重率（%）=（每瓶组培苗培养后的重量-每瓶组培苗接种前的重量）/每瓶组培苗接种前的重量×100

平均每株分蘖数=每瓶培养基中全部植株萌发新芽数之和/每瓶培养基接种的植株数

1. 2. 2 不同钾离子含量响应试验 在1.2.1试验中发现因素钾对铁皮石斛组培苗相对增重率的影响突出，因此进一步设计单因素试验探讨不同钾离子浓度对铁皮石斛组培苗生长的影响。与1.2.1试验相似，以1/2MS培養基为基础，以钾离子浓度为变量，设k0（0 mmol/L）、k1（5.0 mmol/L）、k2（10.0 mmol/L）、k3（20.0 mmol/L）、k4（30.0 mmol/L）和k5（40.0 mmol/L）6个梯度处理，按照表3的配方配制大量元素溶液。其中k2处理的钾离子浓度接近1/2MS培养基。每处理接种30株，接种80 d后测定植株的相对增重率。

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 16.0进行方差分析，以Duncans进行多重比较。

2 结果与分析

2. 1 不同浓度氮、磷和钾含量配比培养基对铁皮石斛组培苗生长的影响

经过90 d培养，各处理铁皮石斛组培苗叶片增厚，叶色变深，植株有所增高，底部萌发新芽，各测量指标见表4。

极差分析结果（表5）表明，氮元素对株高和平均株分蘖数的影响最大，R（0.30和0.56）均明显大于磷和钾元素；钾元素对新增平均根数和相对增重率的影响最大，R（0.25和65.49）明显大于氮和磷元素；磷元素对新增叶片数的影响最大，R（0.25）明显大于氮和钾元素。方差分析结果（表6）表明，氮、磷和钾元素对铁皮石斛组培苗的株高、叶片数、平均新增根数和平均株分蘖数均无显著影响（P>0.05，下同），但氮元素对株高和平均株分蘖数的影响明显大于磷和钾元素的影响；钾元素对铁皮石斛组培苗相对增重率影响显著（P<0.05，下同）。结合表4中氮元素的正交式试验结果分析，以N2和N3水平（分别为30.0和60.0 mmol/L）对株高和株分蘖数的影响大于N1水平。对钾元素的多重比较分析结果（表7）显示，K3水平与K1水平、K2水平差异显著，K1水平与K2水平差异不显著，以K3水平（钾20.0 mmol/L）的相对增重率最高。

综合考虑极差分析及方差分析结果，可优选出最佳氮、磷和钾含量配比组合。对氮元素而言，极差分析及方差分析结果均表明，其是影响铁皮石斛组培苗株高和分蘖数的首要因素，但对叶片数、平均根数和平均株分蘖数影响不明显（可忽略氮元素对这3个指标的影响）；当取N2水平（氮30.0 mmol/L）时，铁皮石斛组培苗的株高最高，取N3水平（氮60.0 mmol/L）时，分蘖数最多。因此，可考虑在组培苗增殖阶段选用N3水平（氮60.0 mmol/L）、在组培苗壮苗阶段选用N2水平（氮30.0 mmol/L）为培养基中氮含量配比。对钾元素而言，极差分析及方差分析结果均表明，其是影响铁皮石斛组培苗相对增重率的首要因素，极差分析结果显示钾是平均新增根数的最大影响因素，但其对株高、叶片数及相对增重率的影响不明显（可忽略钾元素对这3个指标的影响），当选取K3水平（钾20.0 mmol/L）时，相对增重率和平均新增根数均取得最大值，因而考虑选用K3水平（钾20.0 mmol/L）为培养基中钾含量配比。对磷元素而言，方差分析结果表明其对株高、叶片数、平均新增根数、相对增重率和平均株分蘖数等指标的影响均不明显，但极差分析结果显示其对叶片数的影响排在第一位，取P3水平（磷1.2 mmol/L）时叶片数最多，因而考虑选取P3水平（磷1.2 mmol/L）为培养基中磷含量配比。综上所述，在铁皮石斛组培苗增殖阶段，培养基中最佳氮、磷和钾含量配比组合为N3P3K3，在其壮苗阶段，最佳氮、磷和钾含量配比组合为N2P3K3。

2. 2 不同浓度钾离子含量培养基对铁皮石斛组培苗相对增重率的影响

方差分析及多重比较分析结果（表8）表明，不同浓度钾离子对铁皮石斛组培苗相对增重率的影响差异极显著（P<0.01），随着钾离子浓度的增加，组培苗的相对增重率呈上升趋势，其中以k5处理（钾40.0 mmol/L）的相对增重率最高，比常用1/2MS培养基（k2处理，钾10.0 mmol/L）的相对增重率高50%以上，说明铁皮石斛能耐受较高浓度钾离子，且钾离子含量的增加在一定程度上有利于铁皮石斛种苗的物质积累。

3 讨论

前人对铁皮石斛肥料需求的研究多数以组培苗出瓶后栽培的驯化苗或成苗为对象（白美发，2009；石丽敏等，2013；孔德栋等，2015；张之鹏等，2015），对组培苗阶段大量元素营养需求的精细化研究鲜见报道。本研究以铁皮石斛壮苗阶段组培苗为研究对象，采用3因素3水平的氮、磷和钾元素正交试验设计探讨三大元素营养对其生长的影响，明确其养分需求量。

孔德栋等（2015）以1年生铁皮石斛为试材研究其需肥特点，发现高氮肥显著影响其株高，植株出现徒长现象。张之鹏等（2015）研究不同营养液对铁皮石斛组培苗出瓶后生长的影响，发现氮、磷和钾3种元素对株高均有极显著影响，其影响强弱排序为钾>磷>氮，同时发现随着氮浓度的升高，株高发育受到抑制。本研究中，氮元素对铁皮石斛组培苗株高影响明显，与上述两项研究结果相似，但发现钾和磷对株高影响不显著，可能是本研究所用材料与上述研究材料分别处于瓶苗和驯化苗两个不同阶段，不同生长环境下的生理机制不同所致。本研究还发现，氮浓度取N2水平（30.0 mmol/L）时铁皮石斛组培苗株高最高，取N3水平（60.0 mmol/L）时株高反而有所下降，与张之鹏等（2015）的研究结果相符。此外，本研究发现在一定氮浓度范围内，随着氮浓度的升高，铁皮石斛组培苗的分蘖数呈增加趋势，与孟志霞等（2008）的研究结果一致。由于氮是氨基酸、酰胺、蛋白质、核酸、核苷酸及辅酶等的组成元素，同时叶绿素、某些植物激素、维生素和生物碱等也含有氮，在生命活动中占有首要的地位，故氮肥具有加速植物生长、增加分枝（分蘖）及使营养体健壮的作用（潘瑞炽，2004）。因此，在组培苗分化增殖阶段，可适当增加培养基的氮含量，增加分蘖数以提高组培苗的增殖率；在组培苗壮苗阶段，要相应减少氮含量，以促进植株长高并减少分蘖。生产上，在驯化苗或成苗栽培中，铁皮石斛的老株生长到一定程度便会停止生长，开始落叶并逐渐萎缩，靠老株基部萌发新芽以维持植株生长，新芽的萌发时间一般在春季和秋季，其萌发数量对来年铁皮石斛鲜条的产量有重要影响，如能在铁皮石斛萌发新芽前适当增施氮肥，可增加新芽萌发的数量，有利于植株的更新换代及产量的维持。

石丽敏等（2013）研究发现，喷施磷酸二氢钾能促进铁皮石斛1年生驯化苗增重。孔德栋等（2015）研究指出，适当补充钾肥对铁皮石斛有促壮、增产、增加干物质、增加植株干鲜比、提高叶绿素含量和增加多糖含量的作用。本研究中，钾肥对铁皮石斛组培苗的增产效应与上述两项研究结果相符。本研究中的钾离子含量单因素试验结果表明，铁皮石斛能耐受较高含量钾离子，且增产作用在一定范圍内随着钾离子含量的提高而增大。钾离子作为高等植物唯一普遍需要的一价阳离子，对植物的生长发育起着极重要作用，钾供应充分时，能促进碳水化合物代谢，并加速同化产物向贮藏器官中运输，可提高产量（潘瑞炽，2004）。此外，本研究发现钾含量对铁皮石斛新增根数也有一定影响，因此，在铁皮石斛组培苗的生产中可适当加大钾离子含量，在大棚种植中采收鲜条前增施钾肥，可有利于铁皮石斛根系发育，同时改善铁皮石斛的品质和增加产量。

张之鹏等（2015）研究发现，磷元素对铁皮石斛驯化苗的株高、茎粗及多糖含量均有显著影响。本研究结果与其不一致，极差分析结果显示磷元素对铁皮石斛组培苗的叶片数有一定影响，但方差分析结果并未发现磷元素对各测定生长指标有显著影响，较低含量的磷元素即可满足铁皮石斛组培苗的生长需求。因此，在兰类花卉生产中应改变其营养生长阶段施氮、磷、钾肥为20∶20∶20的比例，适当降低磷元素的施用量，节省成本。

常规铁皮石斛快繁流程包括萌芽、增殖、壮苗和生根等不同阶段，本研究对象为铁皮石斛壮苗阶段的组培苗，但研究结果对快繁的其他阶段也有一定参考价值，实际操作中可在本研究最佳氮、磷和钾含量配比基础上调整培养基的其他组分。此外，为调节各处理氮、磷和钾三大元素的不同比例及保持钙、镁和硫元素的恒定，本研究采用硝酸钾和硝酸铵作为调节试剂，对加入培养基中氮元素的形态未进行详细区分，每处理既含有硝态氮又含有铵态氮，同时个别处理引入了较多的氯离子，这些因素对铁皮石斛生长可能产生一定的影响，在今后的研究中需进一步探讨和对试验方案进行改进。

4 结论

本研究结果表明，氮元素含量对铁皮石斛组培苗株高及分蘖数影响明显，钾元素含量对铁皮石斛组培苗相对增重率影响显著；铁皮石斛组培苗增殖阶段的氮、磷和钾元素最佳含量配比分别为30.0、1.2和20.0 mmol/L，壮苗阶段的氮、磷和钾元素最佳含量配比分别为60.0、1.2和20.0 mmol/L。在铁皮石斛组培苗的实际生产过程中，可在此大量元素含量配比基础上适当添加激素及其他有机营养组分，以促进组培苗生长。

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（責任编辑 思利华）