依兰（番荔枝科）雌配子体发育研究

甘阳英 徐凤霞

摘 要：荔枝科是被子植物的基部类群之一，依兰属是番荔枝科较为原始的类群，其有性生殖过程，特别是胚胎发生与发育的研究结果，可以补充被子植物胚胎学原始特征的相关基础资料。该研究利用常规石蜡切片技术，对依兰胚珠、大孢子和雌配子体的发生发育过程进行了观察。结果表明：依兰的胚珠为倒生胚珠、厚珠心、三层珠被，第三层珠被（中间珠被）发生在大孢子母细胞时期，于外珠被与内珠被之间、胚珠合点端两侧发生并隆起；雌配子体为蓼型。此外，依兰的个别胚珠中存在双雌配子体现象，且两个雌配子体均由大孢子母细胞发育而来，大小、形状相近，呈线形排列。该研究结果对于揭示原始被子植物胚胎发育特征具有重要意义。

关键词：胚珠， 大孢子， 蓼型雌配子体， 三层珠被， 多胚

中图分类号：Q945.6

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2017）04-0517-07

Abstract：Annonaceae is one of the basic groups of angiosperms and Cananga is a primitive genus in it. The study on its embryo development is of great significance to reveal the embryological characteristics of the basic angiosperms.

In this study， the ovule， megaspore and female gametophyte development of C. odorata were studied with the traditional pa-raffin section method. The results showed that the ovules of C. odorata were anatropous， assinucellate and tritegmic. The third integument （or middle integument） occured in the megaspore mother cell stage， initials and enlarges between the inner and outer integuments， on the two sides of the chalaza end. The development of the female gametophyte conformed to the polygonum type. Occassionaly two linear arranged female gametophytes were found in the same ovule and both female gametophytes were developed from megaspore mother cell， with similar size and shape. This study on sexual reproduction process， especially on the process of embryogenesis and development will add some basic information about the primitive embryological features of angiosperms.

Key words：ovule， megaspore， polygonum female gametophyte， tritegment， polyembryony

番荔枝科（Annonaceae）是被子植物基部類群之一，具有物种数量多、变异性大的特点，目前本科已鉴定有129 属，超过2 300种（Li & Michael，2013）。已有的研究中，对番荔枝科大孢子发生和雌配子体形成的研究还很少，国内未见有相关报道，国外也只有少量研究，且大多为早期研究（Oes，1914；Schnarf，1931；Juliano，1935；Corner，1949；Periasamy & Swamy，1959；Kapil & Bhandari，1964；Svoma，1998），而早期的研究由于受技术条件限制，多数文献中的实验结果还是手绘图，直观的胚胎学证据较少。此外，现有的研究仅针对少数几种材料，对于一个变异性丰富的基部类群来说，还不能全面体现该科植物胚胎发育的特征。

依兰（Cananga odorata）属于番荔枝科依兰属植物，依兰属是番荔枝科中比较原始的一个属。针对依兰大孢子发生与雌配子体形成的研究仅见于Periasamy & Swamy（1959），他们通过石蜡切片发现依兰的雌配子体为蓼型，胚珠倒生，厚珠被，在两层珠被之间存在中间珠被；但与早期其他胚胎研究一样，其研究结果是采用手绘图，在一些发育过程的细节上不能提供直观的证据。因此，本研究通过对依兰胚珠、大孢子和雌配子体的发生发育过程进行观察，可以为被子植物胚胎学原始特征提供一些直观、详细的证据。

1 材料与方法

材料为依兰不同花期的花朵，于2012年3月底采自华南植物园。将采集的材料用FAA（95% 乙醇 700 mL、冰醋酸 50 mL、甲醛 50 mL）固定保存。实验时剥取依兰雌蕊，用苏木精整体染色，石蜡切片法制片（切片厚度8～10 μm），中性树脂封藏，于Leica DFC550 （Leica Microsystem， German） 显微镜下进行观察拍照。所有图片采用Photoshop CS5软件处理。

2 结果与分析

2.1 依兰胚珠发育和大孢子发生

依兰的胚珠原基于每年3月发生，心皮的腹缝线处出现短指状突起，形成最初的胚珠原基，每心皮具6～12枚胚珠，2列，倒生胚珠，着生于腹膜上（图版Ⅰ：1-3）。随着胚珠原基的逐渐隆起伸长增大，在顶端的表皮下第二层细胞处分化形成一个孢原细胞（图版Ⅰ：4-6），孢原细胞经有丝分裂形成周缘细胞和造孢细胞（图版Ⅰ：7）。周缘细胞经多次平周和垂周分裂，最后形成多层珠心细胞（图版Ⅰ：7-8）。造孢细胞体积逐渐增大，发育为大孢子母细胞，并具有丰富的细胞质和大的细胞核（图版Ⅰ：8）。此时内珠被已明显分化，为2层细胞组成（图版Ⅰ：8）。

胚珠的体积继续增大，头部逐渐向下弯曲，形成倒生胚珠（图版 Ⅰ：6，8，9）。大孢子母细胞变为椭圆形（图版 Ⅰ：9），开始进行减数第一次分裂，形成二分体，靠近合点端的细胞体积稍大（图版 Ⅱ：1）；减数第二次分裂后形成线形四分体（图版 Ⅱ：2，3）或T形四分体（图版 Ⅱ：4），靠近合点端的一个大孢子发育为功能大孢子，而珠孔端的三个细胞逐渐萎缩、退化消失（图版 Ⅱ：5）。功能大孢子不断膨大，进一步伸长，具有丰富的细胞质。

2.2 雌配子体形成

功能大孢子首先发育成为单核雌配子体，然后进行第一次有丝分裂，形成两个细胞核，二核之间无细胞壁，为二核雌配子体（图版 Ⅱ：6）。二核逐渐移向雌配子体两端，每个配子体再各自进行一次分裂，形成四核雌配子体，两两位于雌配子体两端（图版 Ⅱ：7）。四核雌配子体的每个核再各自进行第三次有丝分裂，形成八核雌配子体（图版 Ⅱ：8）。八核雌配子体形成后，两端各有一个核移向雌配子体中央，在靠近珠孔端的位置汇合，形成二倍体的中央极核。此时，八核雌配子体细胞化，珠孔端的三个细胞形成卵器，包括一个卵细胞和两个助细胞，合点端的三个细胞发育成反足细胞（图版 Ⅱ：8，9）。可见，依兰的雌配子体为蓼型。

2.3 珠被的发生发育

在胚珠原基隆起并产生孢原细胞的时候，由两层细胞组成的内珠被也开始分化并不断伸长（图版Ⅰ：7-8），在大孢子母细胞时期，由4～5层细胞组成的外珠被逐渐分化并不断伸长（图版Ⅰ：8；图版Ⅲ：7）。在大孢子母细胞进入减数分裂的时期，在内外珠被之间靠近合点端的两边，一部分细胞开始脱分化形成分生组织，产生一个4～5层的多细胞并逐渐隆起，形成中间珠被（图版Ⅱ：1-4，6；图版Ⅲ：8）。到雌配子体发育至大孢子四分体时期，珠被基本发育完成并包围整个珠心，内珠被在珠孔处突出，通过平周分裂发育为3～4层细胞，并紧密合在一起，形成一个珠心帽（nucellar cap），将珠心密封（图版Ⅱ：2； 图版 Ⅲ：9）。

2.4 双雌配子体胚珠

实验中多次在一个胚珠中发现双雌配子体的现象（图版 Ⅲ：1-3）。并且两个雌配子体已经发育到单核雌配子体时期（图版 Ⅲ：3），但由于双雌配子体发生概率较低，在有限的材料中暂时未观察到有两个成熟雌配子体共在一个胚珠的情况。

2.5 分泌细胞、维管束与单宁物质

在胚珠与心皮之间形成的空隙中，常见大量分泌细胞（图版 Ⅲ：4）。分泌细胞从胚珠珠柄处一直延伸到珠孔的位置，在雌配子体形成后期，分泌细胞更加明显（图版 Ⅲ：5，6）。在大孢子母细胞开始进行减数分裂时，外珠被纤维素类物质逐渐聚集（图版 Ⅰ：9），并在后期更加明显（图版 Ⅱ：1，5，9）。在雌配子体发育后期，内珠被的内层细胞上有少量单宁类物质聚集（图版 Ⅱ：5； 图版 Ⅲ：6）。

3 讨论

3.1 雌配子体发育类型

从本研究结果来看，依兰的雌配子体发育为典型的蓼型，这与 Periasamy & Swamy（1959）的研究结果一致，同时，也与早期对于番荔枝科其他种胚胎发育研究结果类似（Oes，1914；Schnarf，1931；Juliano，1935；Corner，1949； Kapil & Bhandari，1964；Svoma，1998；Lora等，2010），粗略统计，已有的番荔枝科12属（Annona， Uvaria， Artabotrys，Bocagea，Papualthia，Polyalthia，Xylopia，Tetrameranthus，Disepalum，Mitrephora，Cananga，Miliusa）16种植物的雌配子体发育类型均为蓼型。

3.2 中间珠被

在被子植物中，珠被通常由1～2层组成，一般来讲，双子叶植物合瓣花类的珠心为单层珠被，而较原始的双子叶植物和多数单子叶植物的胚珠为2层珠被（陈树思和唐为萍，1998）。多层珠被在被子植物中较少见，且大多为假种皮，覆盖在内外珠被以外。例如：兰花蕉（Orchidantha chinensis）（温颖群和廖景平，2001）、荔枝（Litchi chinensis）（陈健辉等，2001）、龙眼（Dimocarpus longan）（李金珠，1984）等。陈霞和杜凡（2008）统计，我国具有假种皮的被子植物有26科90属571种。这些假种皮具有一个共同的基本特征，就是包裹種皮，尽管有的完全包裹，有的不完全包裹（成为种阜），但都位于种皮（内外珠被）之外。而在番荔枝科中，发现多个物种在位于两层珠被之间，合点端两侧发育出第三层珠被（中间珠被），Svoma（1998）总结番荔枝科中具有中间珠被的有10 属：鹰爪花属（Artabotrys）、依兰属（Cananga）、Cleistopholis属、Cyathocalyx属、Guamia属、Lettowianthus属、Meiocarpidium属、Mezzettia属、蚁花属（Mezzettiopsis）、Platymitra属（Corner，1949；Periasamy & Swamy，1961； Mohana Rao，1975；Christmann，1985；Steinecke，1993），加上Xylpia 属和Tetrameranthus属共有12属。虽然依兰的中间珠被在早期就有报道（Corner，1949；Periasamy & Swamy，1959），但二者的结果均为手绘图，且对中间珠被的发生时间与过程还没有很详细的说明。本研究对中间珠被的发生时间确定为大孢子母细胞时期，发生的位置为合点端两侧内外珠被之间。Corner（1949）对于成熟的依兰种子结构进行了解剖观察，发现中间珠被不断生长，最终覆盖到珠孔下端，并且在后期木质化，在种子成熟时呈嚼烂状；同时，外珠被最终发育成一层膜状结构。而在那些没有中间珠被的种子中，嚼烂状木质化的覆盖层往往是由外珠被发育而成的。从这个结果来看，中间珠被可能在后期起到替换外珠被功能的作用。

3.3 双雌配子体胚珠

多胚现象广泛存在于被子植物中。据统计，被子植物中具有多胚现象的植物有 59 科 140 属 244 种（Tisserat et al，1979），主要集中在风媒植物、水生植物、寄生或附生植物中（邢树平等，1998）。多胚现象根据胚胎的来源可分为配子体型和孢子体型，被子植物中的多胚大多为无融合多胚（Batygina & Vinogradova，2007），如亚麻科亚麻属（Linum）（康庆华等，2011）、禾本科早熟禾（Poa annua）（田震霞，2014）、稻属（Oryza）（Mu et al，2010）、芸香科柑橘属（Citrus）（张斯淇等，2014）、蔷薇科苹果属（Malus xiaojinensis）（杨晓红和周志钦，2009）等。但也有一些多胚是由配子体发育而来的，如波喜荡草科波喜荡草属的Posidonia oceanica 的双雌配子体（Balestri et al，2008），桦木科铁木属Ostrya virginiana的多雌配子体（邢树平等，1998）、菊科二色金光菊（Rudbeckia bicolor）的双雌配子体（Musiaet al，2012）等，都是大孢子母细胞发育而来的。

有关多雌配子体现象在被子植物基部类群中发生的报道较少。在林仙科（Winteraceae）部分种的个别胚珠中发现过二个大孢子母细胞或双雌配子体的现象（Bhandari，1963；Bhandari & Venkataraman，1968）。在番荔枝科中，仅Juliano（1935）发现在刺果番荔枝（Annona muricata）的少数胚珠中有并列两个大孢子母细胞和两个雌配子体的现象，由于Juliano同时发现番荔枝（Annona squamosa）的大孢子母细胞在分裂形成4个大孢子后，靠近合点端的两个大孢子均增大并呈现功能大孢子的特征，并且观察到刺果番荔枝的二个雌配子体间只有一层膜细胞相隔，因此他推测刺果番荔枝的双雌配子体可能是来源于相邻两个大孢子共同作为功能大孢子发育而来的，并且认为两个雌配子体极有可能在后期发生融合。本研究中在依兰的胚珠中，多次发现双雌配子体现象，并且均为正常的雌配子体发育，大小形态相近，总体呈直线排列，与线形大孢子四分体的结构有相近之处，但二个雌配子体间隔有2～3层细胞，这又与Juliano（1935）的发现不同。这个结果的原因可能有两个：其一是两个雌配子体是源自两个不同的大孢子母细胞，其二是两个雌配子体源自四分体大孢子中间隔的两个大孢子（如第二、四个大孢子或第一、三个大孢子）。不过由于双雌配子体发生的概率很低，因此研究材料十分有限，对于双雌配子体的发生机理和发育过程的完整了解，还有待于进一步研究。但可以肯定的是，在番荔枝科的原始种依兰中和进化种刺果番荔枝中均存在双雌配子体现象，且他们的双雌配子体类型都是配子体型。

参考文献：

BALESTRI E， LUCCARINI G， LARDICCI C， 2008. Abnormal embryo development in the seagrass Posidonia oceanica [J]. Aquat Bot， 89（1）：71-75.

BATYGINA TB， VINOGRADOVA GY， 2007. Phenomenon of polyembryony. Genetic heterogeneity of seeds [J]. Ontogenez， 38（3）：166-191.

BHANDARI NN， 1963. Embryology of Pseudowintera colorata—a vesselless dicotyledon [J]. Phytomorphology， 13（1）：303-316.

BHANDARI NN， VENKATARAMAN R， 1968. Embryology of Drimys winteri [J]. J Arnold Arbor， 49（4）：509-524.

CHEN JH， YANG JH， PAN KQ， 2001. Study on developmental process of aril in seedless-litch [J]. Guihaia， 21（4）：362-366. [陳健辉， 杨俊慧， 潘坤清， 2001. 无核荔枝假种皮发育过程的研究 [J]. 广西植物， 21（4）：362-366.]

CHEN SS， TANG WP， 1998. Integument and its development [J]. Bull Biol， 33（6）：4-5. [陈树思，唐为萍. 1998. 珠被及其发育 [J]. 生物学通报，33（6）：4-5.]

CHEN X， DU F， 2008. Advances in study on aril of spermatophyte [J]. J SW For Univ， 28（1）：34-38. [陈霞， 杜凡， 2008. 种子植物假种皮研究综述 [J]. 西南林学院学报， 28（1）：34-38.]

CHRISTMANN M， 1985. Beitrge zur Histologie der Annonaceen-Samen [D]. Rheinland-Pfalz：University of Kaiserslautern， Germany.

CORNER EJH， 1949. The Annonaceous seed and its four integuments [J]. New Phytol， 48（3）：332-364.

JULIANO JB， 1935. Morphological contribution on the genus Annona Linn [J]. Philipp Pine Agric， 24（1）：528-541.

KANG QH， XU H， GUANG FZ， et al.， 2011. Research and application of polyembryonic germplasm [J]. Plant Fiber Sci Chin， 33（4）：179-182. [康庆华， 徐涵， 关凤芝， 等， 2011. 多胚亚麻种质的研究与利用 [J]. 中国麻业科学， 33（4）：179-182.]

KAPIL RN， BHANDARI NN， 1964. Morphology and embryology of Magnolia Dill. ex Linn [J]. Proc Nat Acad Sci， India， Sec. B， 30（1）：245-262.

LI PT， 1976. Some notes on the Annonaceae of China [J]. J Syst Evol，14（1）：96-113. [李秉滔， 1976. 中國番荔枝科的研究 [J]. 植物分类学报， 14（1）：96-113.]

LI BT， MICHAEL， 2013. Annonaceae [M]// The Editorial Board of Flora of China. Flora of China. Beijing：Science Press； Missouri：Missouri Botanical Garden Press， 19：672-713.

LI JZ， 1984. Studies on fertilization of Dimocarpus longana [J]. Acta Hortic Sin， 11（4）：243-247. [李金珠， 1984. 龙眼受精作用的研究 [J]. 园艺学报， 11（4）：243-247.]

MOHANA RAO PR， 1975. Seed anatomy of Artabotrys odoratissimus with a discussion on chalaza， integumentary bundles and ruminate endosperm [J]. Phytomorphology， 25（1）：215-228.

MUSIA K， KOS'CIN'SKA-PAJAK M，SLIWINSKA E，et al， 2012. Developmental events in ovules of the ornamental plant Rudbeckia bicolor Nutt [J]. Flora， 207（1）：3-9.

MU XJ， JIN B， TENG NJ， 2010. Studies on the early development of zygotic and synergid embryo and endosperm in polyembryonic rice ApIII [J]. Flora， 205（6）：404-410.

OES A， 1914. Beitrge sur Entwicklungsgeschichte der Annonaceen. Verh. naturf. Ges [J]. Basel， 25：168-178.

PERIASAMY K， SWAMY BGL， 1959. Studies in the Annonaceae I. Microsporogenesis in Cananga odorata and Miliusa Wightiana [J]. Phytomorphology， 9（1）， 251-63.

PERIASAMY K， SWAMY BGL， 1961. Studies in the Annonaceae. II. The development of ovule and seed in Cananga odorata and Miliusa wightiana [J]. J Ind Bot Soc， 40（1）：206-216.

SCHNARF K， 1931. Vergleichende embryologie der angiospermen [M]. Berlin：Bomtraeger.

STEINECKE H， 1993. Embryologische， morphologische und systematische untersuchungen ausgewhlter Annonaceae [J]. Dissert Bot， 205（1）：1-237.

SVOMA， 1998. Studies on embryology and gynoecium structures in Drimys winteri （Winteraceae） and some Annonaceae [J]. Plant Syst Evol， 209（3-4）：205-229.

TIAN ZZ， 2014. Embryo types and characteristics of apomixis in Poa pratensis L. [D]. Lanzhou：Gansu Agricultural University. [田震霞， 2014. 草地早熟禾胚胎发育特征的研究 [D]. 兰州：甘肃农业大学.]

TISSERAT B， ESAN EB， MURASHIGE T， 1979. Somatic embryogenesis in angiosperms [J]. Hortic Rev， 1（1）：1-78.

WEN YQ， LIAO JP， 2001. Embryological study of Orchidantha chinensis （Lowiaceae） [J]. J Trop Subtrop Bot， 9（4）：301-305. [温颖群， 廖景平， 2001. 兰花蕉的胚胎学研究 [J]. 热带亚热带植物学报， 9（4）：301-305.]

XING SP， CHEN ZD， LU AM， 1998. Development of ovules and embryo sacs in Ostrya virginiana （Betulaceae） and its systematic significance [J]. Acta Phytotax Sin， 36（5）：428-435. [邢树平，陈之端，路安民， 1998. Ostrya virginiana（Betulaceae）的胚珠和胚囊发育及其系统学意义 [J]. 植物分类学报，36（5）：428-435.]

YANG XH， ZHOU ZQ， 2009. Anatomical characters of apomixes development in the gynoecia of Malus xiaojinensis [J]. J Fruit Sci， 26（1）：1-5. [杨晓红， 周志钦， 2009. 小金海棠雌蕊无融合生殖发育的解剖学结构观察 [J]. 果树学报， 26（1）：1-5.]

ZHANG SQ， XU Q， DENG XX， 2014. Advances in apomixes and polyembryony research in Citrus plants [J]. Plant Sci J， 32（1）：88-96. [张斯淇，徐强，邓秀新， 2014. 无融合生殖与柑橘多胚现象的研究进展 [J]. 植物科学学报， 32（1）：88-96.]