山绿茶中9种化学成分的分离与表征

2017-05-30马剑霜湛志华薛茗月陈全斌

企业科技与发展 2017年8期

马剑霜湛志华薛茗月陈全斌

【摘要】利用硅胶柱层析和TLC方法，对山绿茶的石油醚和乙酸乙酯提取物进行分离，并利用重结晶进行了进一步的纯化，然后通过熔点测定、核磁测定等方法对分离出的9个化合物进行了鉴定。9个化合物分别是山奈酚、β-香树脂酮、2-咖啡酰氧甲基-1-丁烯-3.4-二醇、（+）-环合橄榄树脂素、芦丁、熊果酸、槲皮素、大豆苷元、β-乳香酸。

【关键词】山绿茶；提取；结构

【中图分类号】R284.1 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2017）08-0065-04

山绿茶是海南冬青（Ilex Hainanensis Merr）叶的炮制品，海南冬青属于冬青属植物，主要分布在我国的华东和西南地区，是一种分布广泛的常青植物。山绿茶具有降血压、降血糖、降血脂等疗效，作为一种降血压的中药，在广西部分地区得到广泛的使用，其相关制剂是广西一些制药厂的龙头产品，有良好的经济效益和发展前景。国内外已有不少研究人员对山绿茶的化学成分和醇提物的动物实验、临床实验进行了研究，结果表明，山绿茶中含有多种活性成分和具有降压的效果。为了全面地了解山绿茶，本文对山绿茶的化学成分进行化学成分的分离、理化性质检测和结构鉴定。

1 原材料、试剂及仪器

1.1 原材料、试剂

山绿茶（桂林中族中药股份有限公司）；石油醚（AR，60～90 ℃）；二氯甲烷（AR）；氯仿（AR）；丙酮（AR）；乙酸乙酯（AR）；乙醇（AR）；甲醇（AR）；柱层析硅胶（100～200目，300～400目，青岛海洋化工有限公司）；薄层色谱硅胶（GF254，青岛海洋化工有限公司）；CM纤维素钠盐800～1200目（CP，国药集团化药试剂有限公司）。

1.2 仪器

上海亚荣生化仪器厂生产的RE-52A型旋转蒸发仪；北京赛多利斯仪器系统有限公司生产的WS210S型电子天平；郑州长城科工贸有限公司生产的SHB-IIIS循环水式真空泵和DLSB-5/20低温冷却循环泵；巩义市予华仪器责任有限公司生产的SKSY-4电子恒温水浴锅；山海市实验仪器总厂生产的ZK-82BB型电热真空干燥箱；上海科导超声仪器有限公司生产的K8200LH超声波清洗仪；瑞士Bruker公司生产的BrukerAV500MHz/DRX500超导核磁共振仪；大连依利特分析仪器有限公司生产的UV200Ⅱ紫外可变波长检测器；上海精密科学仪器有限公司赛多利斯生产的WRS-1B数字熔点仪。

2 提取及分离

2.1 山绿茶不同溶剂提取分离

将7.5 kg的山绿茶风干粉碎，用75%的乙醇热回流提取3次，过滤并回收溶剂，得到525 g的褐色浸膏。将浸膏中加入适量的蒸馏水，充分搅拌后得到提取物的悬浮液，将其加入分液漏斗中，然后用石油醚（3×2 000 mL）、氯仿（3×2 000 mL）、乙酸乙酯（3×2 000 mL）依次萃取并回收溶劑，得到石油醚部分（47.2 g）、氯仿部分（101.8 g）、乙酸乙酯部分（268.6 g）、水部分（102.5 g）。

针对石油醚部分和乙酸乙酯部分，采用硅胶柱层析分离结合TLC方法，利用石油醚-乙酸乙酯、石油醚-氯仿、乙酸乙酯-甲醇等溶剂体系进行梯度洗脱，石油醚、丙酮、甲醇等溶剂反复重结晶后，成功分离纯化得到9个单体化合物。

3 化合物的理化性质和结构鉴定

（1）化合物1。淡黄色粉末，mp：279.5～281.2 ℃，易溶于丙酮。TLC检测：氯仿∶甲醇=9∶1展开，Rf=0.39，紫外灯下和碘缸中均显色，盐酸-镁粉反应呈阳性，喷1% AlCl3-EtOH溶液并加热后显黄色。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：6.25（1H，d，J=1.9），6.50（1H，d，J=1.9），8.11（2H，d，J=8.3），6.99（2H，d，J=8.3），6.99（2H，d，J=8.3），8.11（2H，d，J=8.3）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：147.7（C-2），136.6（C-3），176.8（C-4），161.6（C-5），99.2（C-6），164.9（C-7），94.4（C-8），157.1（C-9），103.9（C-10），122.6（C-1'），130.4（C-2'），116.4（C-3'），160.1（C-4），116.4（C-5'），130.4（C-6'）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）谱图中δH（ppm）：6.25（1H，d，J=1.9 Hz）和6.50（1H，d，J=1.9 Hz）为A环上H-6和H-8的化学位移，由此可得A环为5、7-二取代。8.11（2H，d，J=8.3 Hz）为B环上H-2'和H-6'的化学位移，6.99（2H，d，J=8.3 Hz）为B环上H-3'和H-5'的化学位移，由此可得B环为4'取代。13C-NMR（100 MHz，DMSO）谱图中δC（ppm）：176.34为羰基碳的化学位移，98.69和93.86分别为C-6和C-8的化学位移，130.43的重叠峰为C-2'和C-6'的化学位移，116.37的重叠峰为C-3'和C-5'的化学位移。与文献[1]中的1H-NMR和13C-NMR对比，最终确定该化合物为山奈酚。

（2）化合物2。白色针状晶体，mp：159.4～160.7 ℃，易溶于氯仿和甲醇。紫外灯下不显色，碘缸中显色，喷10% H2SO4-EtOH溶液并加热后显红色。13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：40.1（C-1），32.4（C-2），215.3（C-3），50.6（C-4），51.7（C-5），19.4（C-6），32.1（C-7），40.0（C-8），47.0（C-9），37.7（C-10），21.6（C-11），122.2（C-12），141.2（C-13），14（C-14），29.4（C-15），25.9（C-16），32.3（C-17），37.7（C-18），46.3（C-19），32.1（C-20），33.6（C-21），36.9（C-22），25.9（C-23），19.9（C-24），12.5（C-25），12.7（C-26），23.5（C-27），26.5（C-28），32.3（C-29），22.5（C-30）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）譜图中0.69～1.25共有24个H，为7个-CH3的化学位移。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）谱图中显示出30个C的化学位移。与文献[2-3]中的13C-NMR对比，最终确定该化合物为β-香树脂酮。

（3）化合物3。淡黄色胶状，易溶于甲醇。紫外灯下和碘缸中均显色，FeCl3反应呈阳性。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：5.29（2H，d，J=20.2），4.26（1H，dd，J=4.1，8.1），3.65（2H，dd，J=7.9，4.0），4.74（2H，d，J=16.0），7.06（1H，d，J=2.0），6.79（1H，d，J=8.1），6.96（1H，dd，J=8.1，2.0），7.58（1H，d，J=16.0），6.30（1H，d，J=16.0）。13C-NMR（MeOD，100 MHz）δ：114.6（C-1），145.9（C-2），74.6（C-3），66.5（C-4），65.3（C-5），127.7（C-1'），114.9（C-2'），146.8（C-3'），149.7（C-4'），116.5（C-5'），123.0（C-6'），147.2（C-7'），115.2（C-8'），168.8（C-9'）。1H-NMR（400 MHz，MeOD）谱图中δH（ppm）：7.06（1H，d，J=1.3 Hz）、6.79（1H，d，J=8.2 Hz）和6.96（1H，dd，J=8.1，2.0 Hz）为苯环上2'、5'和6'氢的化学位移，7.58（d，J=15.9 Hz）和 6.30（d，J=15.9 Hz）为碳碳双键上反式氢的化学位移，再结合碳谱可得，该化合物中存在一个咖啡酰基。氢谱中5.29（2H，d，J=20.2 Hz）、4.26（1H，dd，J=4.1，8.1 Hz）、3.65（2H，dd，J=7.9，4.0 Hz）、4.74（2H，d，J=16.0 Hz）为氧化半萜氢的化学位移，再结合碳谱可得，该化合物中存在一个氧化半萜。与文献[4]中的1H-NMR和13C-NMR对比，最终确定该化合物为2-咖啡酰氧甲基-1-丁烯-3.4-二醇。

（4）化合物4。白色粒状晶体，mp：173.8～174.9 ℃，易溶于甲醇。紫外灯下和碘缸中均显色，FeCl3反应呈阳性。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：6.71（1H，d，J=4.0），6.78（1H，d，J=7.9），6.68（1H，dd，J=1.5，7.9），4.03（1H，d，J=12.1），2.03（1H，dd，J=2.6，11.6），3.58（2H，d，J=3.9），6.65（1H，s），6.20（1H，s），3.23（1H，d，J=16.5），3.85，3.56（1H，m）。13C-NMR（MeOD，100 MHz）δ：133.5（C-1），113.9（C-2），149.1（C-3），146.0（C-4），116.0（C-5），123.5（C-6），44.8（C-7），47.5（C-8），60.8（C-9），138.4（C-1'），112.9（C-2'），147.5（C-3'），145.2（C-4'），117.3（C-5'），126.4（C-6'），39.9（C-7'），74.9（C-8'），69.4（C-9'）。1H-NMR（400 MHz，MeOD）譜可知，有5个苯环上氢的化学位移，3组亚甲基氢的化学位移，2个次甲基氢的化学位移，2组甲氧基氢的化学位移。13C-NMR（100 MHz，MeOD）谱图中显示出20个C的化学位移。与文献[5]中的1H-NMR和13C-NMR对比，最终确定该化合物为（+）-环合橄榄树脂素。

（5）化合物5。淡黄色针状，mp：179.7～181.0 ℃，易溶于乙醇。TLC检测：乙酸乙酯∶乙醇=3∶2展开，Rf=0.33，紫外灯下和碘缸中均显色，盐酸-镁粉反应呈阳性，喷1% AlCl3-EtOH溶液并加热后显黄色。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：6.32（1H，d，J=2.1），6.67（1H，d，J=2.1），7.66（1H，d，J=1.9），6.99（2H，d，J=8.3），6.67（2H，d，J=8.5），7.53（1H，dd，J=9.1，1.9），5.32（1H，d，J=7.6 Hz），4.38（1H，d，J=1.0 Hz），0.93（3H，d，J=7.6 Hz）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：156.4（C-2），133.6（C-3），177.4（C-4），160.8（C-5），98.3（C-6），164.6（C-7），92.8（C-8），156.5（C-9），101.2（C-9），122.3（C-1'），112.6（C-2'），145.9（C-3'），150.8（C-4'），115.7（C-5'），122.4（C-6'），39.9（C-7'），74.9（C-8'），69.4（C-9'）。Glu-，105.0（C-1''），74.1（C-2''），76.3（C-3''），70.3（C-4''），75.9（C-5''），68.2（C-6''），Rha-，100.9（C-1'''），70.4（C-2'''），70.5（C-3''），71.6（C-4'''），70.1（C-5'''），17.6（C-6'''）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）谱中δH（ppm）：6.32（1H，d，J=2.1 Hz）和6.67（1H，d，J=2.1 Hz）为A环上H-6和H-8的化学位移，由此可得A环为5、7-二取代，12.38（1H，s）和10.66（1H，s）分别为5、7-二取代羟基氢的化学位移。7.66（1H，d，J=1.9 Hz）、6.67（1H，d，J=8.5 Hz）和7.53（1H，dd，J=9.1，1.9 Hz）為B环上H-2'、H-5'和H-6'的化学位移，由此可得B环为3、4-二取代，9.25（1H，s）和9.21（1H，s）分别为3、4-二取代羟基氢的化学位移。9.48（1H，s）为C环上3取代羟基氢的化学位移。4.38（1H，d，J=1.0 Hz）和5.32（1H，d，J=7.6 Hz）分别为α鼠李糖和β构型葡萄糖端基氢的化学位移。13C-NMR（100 MHz，DMSO）谱图中，有15个碳的化学位移归属于黄酮苷元，剩下的12个碳的化学位移归属于鼠李糖和葡萄糖。与文献[6]中的1H-NMR和13C-NMR对比，最终确定该化合物为芦丁。

（6）化合物6。白色针状晶体，mp：281.2～283.0 ℃，易溶于丙酮、乙酸乙酯。TLC检测：氯仿∶乙酸乙酯=4∶1展开，Rf=0.42，紫外灯下不显色，碘缸中显色，喷10% H2SO4-EtOH溶液并加热后显红色，Libermman-Burchard反应呈阳性。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：3.17（1H，dd，10.8，4.9），5.13（1H，t，3.5），0.82（3H，d，4.6），0.91（3H，d，2.9）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：39.1（C-1），26.9（C-2），76.8（C-3），39.3（C-4），54.8（C-5），18.0（C-6），32.7（C-7），40.1（C-8），46.8（C-9），38.2（C-10），23.8（C-11），124.5（C-12），138.2（C-13），41.6（C-14），28.2（C-15），22.8（C-16），46.6（C-17），52.4（C-18），39.9（C-19），39.7（C-20），30.1（C-21），38.3（C-22），（30.2C-23），15.2（C-24），16.1（C-25），17.0（C-26），23.3（C-27），178.3（C-28），16.9（C-29），21.1（C-30）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）谱图中δH（ppm）：11.97（1H，brs，COOH）为羧酸上氢的化学位移，5.13（1H，t，J=3.5 Hz，H-12）为碳碳双键上氢的化学位移，3.17（1H，dd，J=10.8，4.9 Hz，H-3）为次甲基上氢的化学位移，1.04、0.89、0.87、0.80、0.75、0.68单峰和0.91、0.82双峰为甲基上氢的化学位移。13C-NMR（100 MHz，DMSO）谱图中δC（ppm）：178.28为羧酸上碳的化学位移，138.17、124.55为碳碳双键上碳的化学位移，76.80为与羟基相连碳上的化学位移，此外，谱图中碳原子的个数为30。与文献[7]中的1H-NMR和13C-NMR对比，最终确定该化合物为熊果酸。

（7）化合物7。黄色粉末，mp：309.1～311.3 ℃，易溶于丙酮。TLC检测：氯仿∶甲醇=9∶1展开，Rf=0.27，紫外灯下和碘缸中均显色，盐酸-镁粉反应呈阳性，喷1% AlCl3-EtOH溶液并加热后显黄色。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：6.06（1H，d，J=1.7），6.28（1H，d，J=2.0），7.56（1H，d，J=1.7），6.77（1H，d，J=8.6），7.43（1H，dd，J=8.6，1.7）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：148.1（C-2），136.2（C-3），176.3（C-4），161.2（C-5），98.6（C-6），164.3（C-7），93.8（C-8），156.6（C-9），103.5（C-10），122.4（C-1'），115.5（C-2'），145.5（C-3'），147.2（C-4'），116.1（C-5'），120.4（C-6'）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）谱图中δH（ppm）：6.06（1H，d，J=1.7 Hz）和6.28（1H，d，J=2.0 Hz）为A环上H-6和H-8的化学位移，由此可得A環为5、7-二取代，12.38（1H，s）和10.66（1H，s）分别为5、7-二取代羟基氢的化学位移。7.56（1H，d，J=1.7 Hz）、6.77（1H，d，J=8.6 Hz）和7.43（1H，dd，J=8.6，1.7 Hz）为B环上H-2'、H-5'和H-6'的化学位移，由此可得B环为3、4-二取代，9.25（1H，s）和9.21（1H，s）分别为3、4-二取代羟基氢的化学位移。9.48（1H，s）为C环上3取代羟基氢的化学位移。13C-NMR（100 MHz，DMSO）谱图中δC（ppm）：176.34为羰基碳的化学位移，98.69和93.86分别为C-6和C-8的化学位移，这是5、7-二羟基黄酮的特征峰。此外，谱图中碳原子的个数为15。与文献[8]中的1H-NMR和13C-NMR对比，最终确定该化合物为槲皮素。

（8）化合物8。浅黄色针状晶体，mp：313.4～314.7 ℃，易溶于甲醇。TLC检测：氯仿∶甲醇=96∶4展开，Rf=0.50，紫外灯下和碘缸中均显色，FeCl3反应呈阳性。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：7.95（1H，d，J=8.5 Hz），6.93（1H，dd，J=8.5，2.1 Hz），6.82（1H，d，J=2.1 Hz），7.39（2H，d，J=8.2 Hz），6.83（2H，d，J=8.2 Hz），6.83（2H，d，J=8.2 Hz），7.39（2H，d，J=8.2 Hz）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：152.8（C-2），123.6（C-3），174.8（C-4），127.4（C-5），115.1（C-6），162.6（C-7），102.2（C-8），157.3（C-9），116.7（C-10），122.7（C-1'），130.2（C-2'），115.1（C-3'），157.5（C-4'），115.1（C-5'），130.2（C-6'）。1H-NMR（400 MHz，DMSO）譜图中δH（ppm）：8.21（1H，s）为羰基β位H-2的化学位移，7.95（1H，d，J=8.5 Hz）和6.93（1H，dd，J=8.5，2.1 Hz）和6.82（1H，d，J=2.1 Hz）为A环上H-5、H-6和H-8的化学位移，由此可得A环为7取代，7.39（2H，d，J=8.2 Hz）为B环上H-2'、和H-6'的化学位移，6.83（2H，d，J=8.2 Hz）为B环上H-3'和H-5'的化学位移，由此可得B环为4'取代。13C-NMR（100 MHz，DMSO）谱图中δC（ppm）：174.88为羰基碳的化学位移，127.4、98.69和93.86分别为C-5、C-6和C-8的化学位移，130.25的重叠峰为C-2'和C-6'的化学位移，115.13的重叠峰为C-3'和C-5'的化学位移。与文献[9]中的1H-NMR和13C-NMR对比，最终确定该化合物为大豆苷元。

（9）化合物9。白色针状晶体，mp：229.5～230.8 ℃，易溶于氯仿和丙酮。紫外灯下不显色，碘缸中显色，喷10% H2SO4-EtOH溶液并加热后显红色。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：32.3（C-1），26.4（C-2），72.2（C-3），46.2（C-4），50.5（C-5），19.8（C-6），（32.3C-7），40.2（C-8），46.2（C-9），36.6（C-10），23.5（C-11），122.2（C-12），141.2（C-13），42.7（C-14），26.7（C-15），28.7（C-16），34.3（C-17），57.2（C-18），37.7（C-19），36.9（C-20），32.1（C-21），42.7（C-22），24.7（C-23），181.2（C-24），12.3（C-25），19.2（C-26），21.5（C-27），29.5（C-28），19.4（C-29），20.2（C-30）。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）谱图中δH（ppm）：5.36（1H，s）为碳碳双键上H的化学位移，0.68～1.00共有21个H，为7个-CH3的化学位移。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）谱图中显示出30个C的化学位移。与文献[10-11]中的1H-NMR和13C-NMR对比，最终确定该化合物为β-乳香酸。

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