响应面优化热浸提法提取石榴皮总多酚的工艺研究

2017-05-30苏娜张丽段龙艳唐春香

安徽农业科学 2017年9期

苏娜张丽段龙艳唐春香

摘要[目的]研究石榴皮中总多酚的热浸提最佳工艺条件并测定其含量。[方法]以石榴皮为原料、纯水为浸提溶剂加热浸提石榴皮中总多酚，通过单因素试验探究了石榴皮总多酚提取率随热浸提温度、时间、料液比以及提取次数4个客观因素的变化规律，并用响应面分析法优化提取工艺，采用Folin-Ciocalteu比色法测定石榴皮总多酚含量。[结果]通过Box-Benhnken响应面分析试验确定以热浸提法提取石榴皮总多酚的最佳工艺为热浸提温度45 ℃、时间30 min、料液比1∶20（g∶mL）、提取次数为3次，4个因素对石榴皮总多酚提取率的影响顺序依次为温度、料液比、提取时间、提取次数，并以此优化工艺进行试验，所得总多酚提取率为17.11%。[结论]采用热浸提工艺提取石榴皮总多酚并用响应面分析法优化试验，在保证快速、高效的同时也具有节能、不破坏有效成分的优势，以纯水作为浸提溶剂更是避免了溶剂残毒问题，极大地提高了其安全性，因此也拓宽了极具生物活性的石榴皮多酚在生产生活领域中的应用。

关键词石榴皮；总多酚；提取工艺；响应面分析

中图分类号S665.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）09-0078-06

Optimization of Extraction Process of Total Polyphenols from Pomegranate Peel by Response Surface Method

SU Na， ZHANG Li*， DUAN Longyan et al

（College of Science， Honghe University， Mengzi， Yunnan 661199）

Abstract[Objective] To study the optimal conditions for extraction of total polyphenols from pomegranate peel and determine its content. [Method] With pomegranate peel as raw material， pure water as solvent， total polyphenols were extracted from pomegranate peel. The variation law of yield of total polyphenols with temperature， time， solidliquid ratio and extraction times was explored by single factor test， the extraction process was optimized and perfected by response surface analysis， and content of total polyphenols in pomegranate peel was determined by FolinCiocalteu colorimetric method. [Result] The optimal conditions were as following： temperature 45 ℃， time 30 min， solidliquid ratio 1∶20（g∶mL）， extraction times 3. The order of influence degree from high to low was temperature， solidliquid ratio， time， extraction times. Under the above conditions， the yield of total polyphenols could up to 17.11%. [Conclusion] Using heat extraction and response surface method is not only fast， efficient but also energysaving and undamaged. With pure water as extraction solvent can avoid the problem of residual hazard， greatly improve its security， and thus widen the highly bioactive pomegranate peel polyphenols applied in the field of production and living situation.

Key wordsPomegranate peel；Total polyphenols；Extraction process；Response surface analysis

石榴屬于被子植物，主要分布在亞热带及温带地区，是一种营养丰富的稀有浆果。

石榴成熟后，果实可食用或榨汁，果皮可入药，其果皮中含有丰富的多酚类物质[1]。石榴多酚是石榴果皮中含量较为丰富的一类化合物，其组成成分主要包括鞣花酸、安石榴苷、没食子酸、儿茶素、儿茶酚、绿原酸等其他化合物。研究表明，石榴皮中的多酚物质具有抗氧化、抗衰老、抗癌防癌、抗菌、润肤、美容、降血压和预防心脑血管疾病的功能[2-5]。石榴性温，味甘酸涩，入经肺、肾、大肠，能有效止血止泻、生津止渴，还可治疗久泻、便血等病状，对大多数革兰氏细菌有明显的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌作用最强；对大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌也有比较好的抑制作用。目前认为，石榴皮对多种细菌、真菌和霉菌等的抑制作用可能与其所含的鞣质（多酚）成分有关[6-7]。石榴富含多种营养成分和生理活性成分，因而具有极高的营养、保健及药用价值（可作为制作保健食品的功能成分）。

目前，在石榴皮多酚提取工艺的研究中，大多采用溶剂浸提法，且其提取溶剂大多采用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，很少以水作为提取溶剂，这是由于有机溶剂浸提法相对于水提取法提取率较高。以有机溶剂作为提取溶剂存在溶剂残毒的问题，同时提取成本也较高，从而导致其提取物不能有效地应用于生产生活领域[8]。以纯水作为提取溶剂，相对于前者方法简便，成本较低，且无溶剂残毒后患，其提取物可广泛应用于食品、药品生产加工领域。

笔者以石榴皮为原料，以纯水作为提取溶剂加热浸提石榴皮中总多酚，操作方便、取材简便、经济环保且可实现最终提取物无溶剂残毒。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料。

石榴皮粉：于蒙自石榴园采摘新鲜石榴，取其皮后经烘箱干燥8 h，粉碎后过40目筛，于包装袋中密封保存，置于干燥、避光的环境中。

1.1.2主要试剂。

无水碳酸钠（AR），蒙自市沪泰物资责任有限公司；没食子酸（AR），天津市鼎盛鑫化工有限公司；福林酚试剂（BR），南京奥多福尼生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器设备。

SK5200HP超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；

TDL80-2B型离心机，上海安亭科学仪器厂；

WFJ2000型可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；

SHZ-ⅢA循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；

DHG-9003 电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1总多酚的提取工艺流程。

石榴皮→干燥→粉碎→过筛→溶剂浸提→过滤→离心→上清液→蒸发浓缩→定容。

1.2.2

总多酚提取率的测定。采用 Folin-Ciocalteu比色法[9]测定石榴皮总多酚提取率，以没食子酸为标准品。

1.2.2.1

绘制多酚标准曲线。称取没食子酸0.012 5 g，用蒸馏水溶解并定容至500 mL，得到浓度为 0.025 mg/mL 的标准溶液，准确吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、70、8.0、9.0 mL 置于25 mL的棕色容量瓶中，分别加入福林酚试剂 1.0 mL，混匀，在0.5～8.0 min 内加入4 mL 15%的Na2CO3溶液，充分混合后用纯水定容，室温下避光静置 1 h，以不加标准液的试样为空白对照，在765 nm波长下测定吸光值，每个样品平行测定3次。以没食子酸在反应体系中的质量浓度（x）为横坐标，吸光值（y）为纵坐标，绘制标准曲线（图1），所得标准曲线线性方程为 y=0.117 2x+0.012 3，R2=0.999 1 。

1.2.2.2

样品测定。准确吸取石榴皮多酚提取液1.0 mL于25 mL的棕色容量瓶中，加入福林酚试剂1.0 mL，混匀，在0.5～8.0 min 内加入4 mL 15%的Na2CO3溶液，充分摇匀后用纯水定容，室温下避光静置1 h，以纯水作为空白对照，在765 nm波长下测定吸光值，每个试样平行测定3次。

1.2.2.3总多酚提取率计算。

石榴皮总多酚提取率=所得提取液中总多酚质量/石榴皮粉质量×100%。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1石榴皮中总多酚提取率随温度的变化规律。

准确称取3 g石榴皮粉，在热浸提时间为30 min、料液比为1∶20（g∶mL）、提取次数为1的条件下，探究温度对总多酚提取率的影响，其变化规律见图2。

有研究表明，细胞内物质溶出受制于温度的影响，当温度过低时，细胞内物质溶出的速率慢、效率低；当温度过高时，对于热敏性物质性质产生极大影响，可能破坏其性质，同时能量消耗大[10]。由图2可知，温度升高，总多酚的提取率上升，在60 ℃时总多酚提取率達到最高；60 ℃之后，总多酚提取率随温度的升高反而降低。因此，以60 ℃作为提取温度进行后续试验。

2.1.2石榴皮中总多酚提取率随时间的变化规律。

准确称取石榴皮粉3 g，在提取温度为60 ℃、料液比为1∶20（g∶mL）、提取次数为1的条件下，探究石榴皮中总多酚提取率随时间变化的规律，具体见图3。

图3石榴皮中总多酚提取率随时间的变化规律

Fig.3The change of yield of total polyphenols from pomegranate peel with time

热浸提时间是影响石榴皮总多酚提取率的一个重要因素，热浸提时间过长、过短都不利于石榴皮多酚类物质的有效提取。热浸提时间过短，反应时间短，石榴皮总多酚提取不完全，其提取率低；热浸提时间过长，热敏性物质被破坏，生产效率低，且在长时间加热条件下多酚易氧化而使其活性被破坏[11]，从而使得提取率降低。从图3可以看出，热浸提时间在15～30 min时石榴皮总多酚提取率随时间延长逐渐增高，30 min时总多酚提取率最高，30 min后随提取时间增加石榴皮总多酚提取率逐渐降低。考虑生产效率，选择30 min作为热浸提时间较为合理。

安徽农业科学2017年

2.1.3石榴皮中总多酚提取率随料液比的变化规律。

准确称取石榴皮粉3 g，在固定提取温度为60 ℃、提取时间30 min、提取次数为1的条件下，探究石榴皮总多酚提取率随料液比变化的规律，具体见图4。

图4石榴皮中总多酚提取率随料液比的变化规律

Fig.4The change of yield of total polyphenols from pomegranate peel with solidliquid ratio

料液比是影响原料中多酚提取的重要因素之一。料液比的不同可能造成石榴皮粉末与提取溶剂的接触面积不同，从而影响石榴皮总多酚的提取率。由图4可见，石榴皮总多酚提取率随着料液比中溶剂用量的增加逐渐增高，当料液比为1∶20（g∶mL）时，石榴皮总多酚提取率最大，在1∶20（g∶mL）后石榴皮总多酚提取率随料液比中溶剂用量的增加逐渐降低，同时增加了成本以及造成了试剂浪费。因此，选择1∶20（g∶mL）为最佳料液比进行后续试验。

2.1.4石榴皮中总多酚提取率随提取次数的变化规律。

准确称取石榴皮粉3 g，在提取温度为60 ℃、提取时间为30 min、料液比为1∶20（g∶mL）的条件下，探究石榴皮总多酚提取率随提取次数变化的规律，具体见图5。

图5石榴皮中总多酚提取率随提取次数的变化规律

Fig.5The change of yield of total polyphenols from pomegranate peel with extraction times

由图5可知，总多酚提取率是随着提取次数的增加而增加，提取1、2、3次的总多酚提取率增加较快，即提取效率较高，但3次以后其增加速度逐渐减小并趋于平缓，提取效率不再显著。因为随着提取次数增加石榴皮中的多酚类物质逐渐提取完全并且其他杂质的分解也干扰了总多酚提取率。当提取3次时，总多酚提取率最高，所以选择提取3次为最优提取次数进行后续试验。

2.2响应面法优化石榴皮多酚提取工艺

2.2.1响应面试验因素水平设计。

根据Box-Behnken的中心组合设计原理[12]，结合单因素试验结果，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和提取次数（D）4个因素作为自变量，以石榴皮总多酚提取率为响应值，采用4因素3水平进行响应面分析，试验因素与水平设计见表1。

2.2.2响应面分析方案及结果。

对石榴皮总多酚的水提工艺进行响应面分析，具体试验方案及结果见表2。

利用 Design Expert 8.0软件对表2中29个试验点的因素和响应值进行多元回归拟合，得石榴皮中总多酚提取率（Y）对热浸提温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）以及提取次数（D）的二次多项回归方程为：

Y=16.74-1.20 A-0.27 B-047 C+0.050 D-0.21 AB-0.31 AC-0.042 AD+0.37 BC+011 BD+0.44 CD-057 A2 -1.43 B2 -1.50 C2-1.68 D2。

通过方差分析得出，试验所选用模型的P<0.000 1，故极显著（P<0.05），且模型的确定系数R2=0.962 8，模型的调整确定系数 R2adj为0.925 7，表明该模型拟合程度较好，试验误差极小；再者该模型能解释 92.57%响应值的变化，完全可用此模型对石榴皮总多酚提取工艺进行分析和预测。对所得回归方程系数进行显著性检验，由回归模型方差分析得出提取温度A（P<0.000 1）、時间二次项B2（P<0000 1）、料液比二次项C2（P<0.000 1）及提取次数二次项D2（P<0000 1）对石榴皮提取液中总多酚提取率影响极大；提取时间 B（P=0.035 7）、料液比C（P=0.001 0）、提取温度二次项A2（P=0.002 4）以及料液比与提取次数的交互项CD（P=0044 9）对石榴皮总多酚提取率的影响极显著。由此得出，4个因素对提取率的影响顺序依次为提取温度、料液比、提取时间、提取次数。

2.2.3石榴皮总多酚提取率及各个因素之间的响应面分析。

以所得回归方程为依据，利用Design Expert 8.0软件对其进行绘图分析。通过绘制的等高线图及交互响应曲面图来预测和检验变量的响应值以及确定变量的相互关系。若交互响应曲面图为凸形曲面且开口向下，则表明响应值存在极大值，各因素对石榴皮中总多酚提取率的影响可通过曲线的陡峭程度来判断，曲线越陡峭则表明该因素对石榴皮总多酚的影响越大，其响应值的变化就越大。等高线图也是衡量变量之间交互作用的一个重要表征，若为椭圆的等高线图，则表明交互作用明显；若为圆形的等高线图则说明交互作用不明显[13]。其中提取温度、提取时间、料液比和提取次数有2个因素不变时，另外2个因素及其交互作用对石榴皮总多酚提取率的影响能从交互响应面和等高线图中分析得出。

当液料比为1∶20、提取次数为3时，提取温度与提取时间2个因素之间的交互作用如图6所示，两者交互等高线图呈椭圆形，由此得出这2个因素间的交互作用明显。起初，石榴皮总多酚提取率随着时间和温度的增加而增加，当温度达到60 ℃、时间30 min后，石榴皮总多酚提取率开始呈现下降趋势，并且从图6中可以看出，相对于温度对石榴皮总多酚提取率的影响，时间对其的影响效果更明显，曲线表现为陡峭；当时间为30 min、提取温度为60 ℃时，石榴皮总多酚提取率较高。

当提取时间为30 min、提取次数为3时，提取温度与料液比2个因素之间的交互作用见图7。由图7可得，这2个因素间的交互作用明显。石榴皮总多酚提取率与料液比和提取温度的关系成正比，在温度达到60 ℃、液料比1∶20后，石榴皮总多酚提取率开始下降，并且从图7中可以看出料液比对石榴皮总多酚提取率的影响效果比提取温度对其的影响更为明显，曲线表现为陡峭。石榴皮总多酚提取率在液料比为1∶20、提取温度为60 ℃时较高。

当提取时间为30 min、料液比为1∶20时，提取温度与提取次数2个因素之间的交互作用见图8。其等高线图呈椭圆，则表明这2个因素间交互作用明显。石榴皮总多酚提取率随着提取次数的增加和提取温度的升高而增加，但当提取次数达3次、温度60 ℃后，总多酚含量开始减少，并且从图8中可以看出，提取次数对石榴皮总多酚提取率的影响效果比温度对石榴皮总多酚提取率的影响更加明显，曲线表现为陡峭。当提取次数3次、温度60 ℃时，提取的石榴皮总多酚较多。

当温度为60 ℃，提取次数为3次时，料液比与提取时间2个因素之间的关系见图9。等高线图呈椭圆，则说明这2个因素之间存在明显的交互作用。随着时间和料液比的不

断增加，石榴皮总多酚提取率也在逐渐增大；总多酚提取率

在料液比1∶20、提取时间30 min后开始下降，曲线都呈现平缓趋势，据此得出提取时间和料液比对石榴皮总多酚提取率的影响差别不大。石榴皮总多酚提取率在1∶20的料液比、30 min的提取时间下效果较好。

当温度为60 ℃、料液比为1∶20时，提取次数与时间两者的交互作用见图10。等高线图呈椭圆，两因素间存在明显的交互作用。提取时间和提取次数增加的同时，总多酚提取率上升，但当料液比达1∶20，时间30 min后，总多酚提取率开始下降，二者曲线都渐渐趋向平缓。由此可知，提取次数与时间对石榴皮总多酚提取率的影响差别不大。当时间为30 min、提取次数3次的条件下，石榴皮总多酚提取率较高。

当温度为60 ℃、时间为30 min时，料液比与提取次数2个因素之间的交互作用见图11。等高线图为椭圆，说明这2个因素的交互作用明显。石榴皮总多酚提取率随着提取次数和料液比的增加而增大，在料液比达到1∶20，提取次数3次后，上升的程度开始平缓。因此，石榴皮总多酚提取率在提取次数为3次、料液比1∶20时效果较佳。

2.2.4提取工艺条件的确定。

通过试验辅助软件 Design Expert 8.0 得到最优提取条件为热浸提温度45 ℃、热浸提时间29.63 min、料液比1∶20、提取次数为3次，此时所得石榴皮总多酚提取率为 17.38%。

考虑到实际操作的可行性，将提取条件修正为热浸提温度45 ℃、热浸提时间30 min、料液比1∶20、提取次数为3次，在修正条件下做 3 次平行试验，该工艺条件下石榴皮总多酚提取率为17.11%，与理论值的相对误差极小，表明经响应面分析法优化后的石榴皮总多酚提取工艺具有实际可行性及可操作意义。

3结论

近年来，关于石榴皮多酚的活性研究越来越多，很多研究方法采用有机溶剂提取，但该研究本着环保、经济、有效、无毒无害的研发理念，以纯水作为提取溶剂来研究石榴皮总多酚物质提取工艺，通过单因素试验研究了热浸提温度、提取时间、料液比以及提取次数对石榴皮中总多酚提取率的影響，并且通过响应面分析法优化试验，最终确定用温度45 ℃、时间30 min、料液比1∶20（g∶mL）、提取次数3次作为热浸提法提取石榴皮中总多酚的最佳工艺条件。

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