研究确定UVA损伤人表皮细胞模型的照射剂量

马林琳　毕俊波

【摘要】 目的 研究确定建立长波紫外线（UVA）照射人表皮角质形成细胞（HEKC）损伤模型的照射剂量。方法 选用原代培养的处于指数生长期的HEKC， 将采用UVA剂量为3.07、6.14、12.29、24.58 J

进行照射的设为剂量组， 对未进行UVA照射的设为对照组。细胞损伤程度采用改良四甲基偶氮唑盐 （MTT）法进行检测。结果 HEKC采用3.07 J UVA照射后， 细胞损伤率7.27%；HEKC采用6.14 J UVA照射后， 细胞损伤率32.73%；HEKC采用12.29 J UVA照射后， 细胞损伤率72.73%；HEKC采用24.58 J UVA照射后， 细胞损伤率95.45%；各剂量组吸光度（OD）值及损伤率与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 建立UVA损伤HEKC模型最适照射剂量的IC50值为8.09 J。

【关键词】 长波紫外线；人表皮角质形成细胞；模型；照射剂量

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.31.018

【Abstract】 Objective To research and determine exposure dose in ultraviolet A （UVA）-damaged human epiderm keratinocytes （HEKC） model. Methods HEKC during exponential growth phase in primary culture were taken. Dosage groups included UVA exposure by doses of 3.07， 6.14， 12.29 and 24.58 J， and control group included non-exposed cases. Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） test was applied to detect cellular damage degree. Results After 3.07 J UVA exposure， HEKC had cellular damage rate as 7.27%； After 6.14 J UVA exposure， HEKC had cellular damage rate as 32.73%； After 12.29 J UVA exposure， HEKC had cellular damage rate as 72.73%； After 24.58 J UVA exposure， HEKC had cellular damage rate as 95.45%. The differences of optical delnsity （OD） value and damage rate between each dose group and control group had statistical significance （P<0.05）. Conclusion The optimal dose in establishment of UVA-damaged HEKC model is 8.09 J in IC50.

【Key words】 Ultraviolet A； Human epiderm keratinocytes； Model； Exposure dose

人們对皮肤衰老等问题的关注度逐年提高， 而日光中紫外线是导致人们皮肤衰老因素中最直接的外源性因素之一。研究发现， 紫外线与皮肤晒伤、皮肤老化、皮肤炎症以及皮肤癌的发生发展有着密切的关系[1]。紫外线引起的皮肤衰老通常称为“光老化”， 人体肌肤可以出现不同程度的红斑、变黑以及胶原蛋白的分解变性， 最终出现皮肤弹性降低、色素沉着、毛细血管扩张等。重者可致光敏性皮肤病， 如日光性皮炎（又称晒伤）， 暴露区皮肤瘙痒、刺痛、皮肤脱屑， 还可能溃破结痂。人们迫切的希望寻找到一种有效的紫外线损伤防护产品。建立一个细胞损伤程度适中的UVA损伤HEKC模型， 在体外更好的模拟机体的状况， 既是研究紫外线对人体皮肤损伤的基础， 也是研究开发紫外线防护产品的前提。在建立该模型过程中， 如何确定一个合适的UVA辐照剂量尤为重要。本研究对几种不同剂量UVA的影响进行比较， 拟为UVA损伤HEKC模型选择一个恰当的UVA辐照量。

1 材料与方法

1. 1 材料 UVA光源以及紫外辐照度计（北京师范大学光学仪器厂）。主要仪器及试剂：温度计、Keratinocyte-SFM（GIBCO公司）、DispaseⅡ（Sigma公司）、0.05% Trypsin-EDTA（GIBCO公司）、异丁醇（上海试剂一厂）、MTT（Sigma公司）、磷酸盐缓冲液（PBS）试液（国产分析纯试剂配制）、十二烷基硫酸钠（广州南方化玻公司分装）以及原代细胞培养手术器械。HEKC：健康男性环切术切除的包皮组织， 原代培养得到HEKC。

1. 2 方法

1. 2. 1 HEKC原代培养 皮肤标本经PBS液反复冲洗后， 经酶作用一定时间， 参照陈勇等[2-4]报道的细胞培养方法， 获得HEKC。

1. 2. 2 实验分组 UVA照射剂量分为3.07、 6.14、 12.29、24.58 J剂量组和对照组。

1. 2. 3 细胞接种及处理 HEKC以2×104个/cm2接种到15个∮35 mm培养皿中， 置5%CO2、饱和湿度的培养箱中37℃培养， 生长至指数生长期弃去培养液， 用于实验操作。

1. 2. 4 UVA损伤 通过紫外辐照度计确定6.4 W/cm2的照射强度， 根据不同照射剂量， 确定照射时间分别为8、16、32、64 min。将照射装置置于超净工作台内， 对HEKC进行UVA损伤， 对照组超净台内放置相同时间后培养箱中培养24 h。

1. 2. 5 细胞损伤程度的测定 采用改良MTT法， 于酶标仪双波长下测定OD值。

1. 3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

各剂量组OD值及损伤率与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 小结

为了使模型的建立更具有稳定性， 同时考虑建立模型进行实验研究的现实意义， 采用GWBASIC软件计算UVA照射对细胞损伤程度的IC50值， 通过计算得到UVA照射对HEKC的IC50值为8.09 J。综合分析认为， 建立UVA损伤HEKC模型， 采用8.09 J的UVA辐照剂量， 细胞损伤率维持在50%左右， 细胞损伤程度可控、模型稳定性好。既充分满足实验稳定可靠的同时， 又与体内环境相似， 利于药物疗效的研究， 其现实意义不容忽视。

参考文献

[1] 马林琳， 张玲， 罗敏， 等. UVA损伤人表皮细胞模型中载物界面的选择. 中国实用医药， 2009， 4（5）：1-2.

[2] 陈勇， 戴和平， 龙志高， 等.人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养.湖南医科大学学报， 2003， 28 （5）：481-484.

[3] 孙曙光， 程大胜， 王良喜， 等.表皮细胞培养条件的优化， 山东医药， 2006， 46（5）：13-14.

[4] Qin F， Zan L. Culture Conditions for the Isolation and Growth of Scalper Epidermal Cells in Vitro. Chinese Journal of Zoology， 2003， 38（6）：76-79.

[收稿日期：2016-11-07]