NLRP3炎性体与类风湿关节炎的相关性研究

宋先东　李扬　刘波　　闫昭威　朱敏

[摘要] 目的 探讨NLRP3炎性体与类风湿关节炎的相关性。 方法 选取2015年1～12月我院收治的类风湿关节炎患者（RA）40例为研究组，同时选取同期健康体检人员40例为对照组，比较两组研究对象外周血NLRP3、半胱天冬酶-1（CASP1）以及凋亡斑点样蛋白（PYCARD）mRNA表达水平。 结果 研究组的NLRP3表达显著低于对照组，同时CASP1以及PYCARD表达显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 NLRP3炎性体各个基因mRNA表达在类风湿关节炎患者当中表达异常，表明NLRP3炎性体在炎症反应中有重要影响。

[关键词] NLRP3炎性体；类风湿关节炎；自身免疫性疾病；相关性

[中图分类号] R593.22 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）11-0008-03

Study on the correlation between NLRP3 inflammasome and rheumatoid arthritis

SONG Xiandong1 LI Yang2 LIU Bo1 YAN Zhaowei1 ZHU Min3

1.Department of Second Orthopedics， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China； 2.Department of First Orthopedics， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China； 3.Department of Radiology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between NLRP3 inflammasome and rheumatoid arthritis. Methods Forty patients with rheumatoid arthritis（RA） admitted in our hospital from January to December 2015 were chosen as study group. 40 healthy subjects in the same period were selected as the control group. The mRNA expression levels of NLRP3， caspase-1（CASP1） and apoptotic spot-like protein（PYCARD） in peripheral blood between the two groups were compared. Results The expression of NLRP3 in the study group was significantly lower than that in the control group， and the expressions of CASP1 and PYCARD were significantly higher than those of the control group（P<0.05）. Conclusion The mRNA expression of each NLRP3 inflammasome gene in rheumatoid arthritis is abnormal， indicating that NLRP3 inflammasome has important effect in inflammatory response.

[Key words] NLRP3 inflammasome； Rheumatoid arthritis； Autoimmune diseases； Relevance

類风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）属于自身免疫性疾病的一种，临床表现主要是关节滑膜炎症，关节出现对称性破坏，能够导致患者关节软骨以及关节囊破坏，严重情况下会使患者的关节功能丧失甚至残毁畸形[1]。该病的发病机制还不够明确，研究发现疾病发生发展的过程涉及到免疫反应及各种细胞因子的参与。本研究分析NLRP3炎性体与类风湿关节炎的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2015年1～12月我院收治的类风湿关节炎患者40例为研究组，男32例，女8例，年龄45～69岁，平均（58.1±2.6）岁。所有患者符合类风湿关节炎诊断标准，同时排除合并有心血管疾病以及严重肝肾功能障碍的患者。同时选取同期健康体检人员40例为对照组，男31例，女9例，年龄41～72岁，平均（57.1±1.9）岁。研究对象均未出现实验室指标异常，同时无糖尿病、心血管疾病以及自身免疫疾病。两组患者的一般资料有可比性（P>0.05），均知情同意本研究，并经过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取与合成 抽取患者的外周静脉血3 mL，使用肝素钠进行抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离单个核细胞，然后应用Trizol试剂，根据说明书提取RNA，添加RNA酶水进行溶解[2]。取5 mL RNA样品进行糖凝胶电泳，在糖凝胶图谱中显示18S、28S以及5S条带。紫外分光光度检测RNA在280 nm 以及260 nm波长位置的吸光度（A）值，计算A260/A280比值。cDNA的合成根据逆转录试剂的操作说明进行[3]。

1.2.2 NLRP3、CASP1以及PYCARD基因检测 应用对照组以及研究组的cDNA建立30 μL的反应体系，实现PCR扩增，在-10℃条件下保存，扩增产物应用1%糖凝胶电泳进行检测，使用曝光机曝光拍摄PCR条带图像，应用软件测定灰度值，采用灰度值比表示mRNA的表达[4]。

1.2.3 PCR产物的纯化以及测序 PCR产物在经过凝胶电泳纯化后，回收目的片段，将回收的目的基因再次凝胶电泳分析，核实存在条带后测定目的基因片段的核酸序列[5]。

1.2.4 NLRP3、CASP1以及PYCARD检测 收集两组研究对象外周血PBMCs，裂解60 min后，3000 r/min持续离心20 min并且收集上清。使用BCA法检测蛋白浓度，使用浓缩胶50 V以及分离胶80 V电泳，按照预染指示转移蛋白，使用脱脂牛奶进行封闭。封闭后用NLRP3、CASP1以及PYCARD抗体孵育过夜，使用TBST洗涤3次，10 min/次。孵育过氧化物酶标记羊抗兔IgG 1∶10000，使用曝光机化学曝光后应用软件测定灰度位[6]。

1.3 统计学方法

使用SPSS18.0统计学软件分析数据，计量资料采用（x±s）表示，组间对比应用方差分析及t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

研究组的NLRP3表达显著低于对照组，同时CASP1以及PYCARD表达显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

NLRP3炎性体是在细胞胞浆中广泛存在的一种多蛋白复合物，活化后能够激活CASP1，从而诱导IL-13以及IL-18等分泌，导致炎症反应发生发展[7]。研究显示NLRP3炎性体在CASP1以及类风湿等炎性疾病发展中有重要影响[8]。NLRP3炎性体活化后能够使无活性的CASP1转化为拥有生物活性的CASP1，其中CASP1能够对IL-18等细胞因子进行切割，从而通过活性形式分泌[9]。NLRP3炎性体最早在CASP中发现，研究人员发现其在其他疾病中也有重要的影响，尤其是自身炎症性疾病如类风湿关节炎等[10]。NLRP3炎性体中的基因多态性与类风湿关节炎的早期活动状况、遗传易感性还有药物治疗应答均有密切关系。与此同时，NLRP3炎性体中的基因是否含有同RA存在联系的基因多态性，还需要后续的深入研究。相关研究结果显示，类风湿关节炎患者中的NLRP3炎性体表达以及多态性与患者进行英夫利昔治疗的应答存在密切联系，同时发现NLRP3以及CARD8部分基因位点的多态性与患者易感性联系的证据[11]。

本研究结果显示，NLRP3炎性体中的NLRP3 mRNA表达在研究组明显下降（P<0.05），同时PYCARD mRNA表达在研究组显著上升（P<0.05），CASP1 mRNA表达同样在研究组患者显著上升（P<0.05），表明类风湿关节炎患者NLRP3基因mRNA表达在炎症过程中有负性调控的效果，特别是在患者非急性期有更为突出的表现[12]。PYCARD及CASP1基因的mRNA表达则在类风湿关节炎患者炎症进展中发挥协同影响。有研究通过检测NLRP3炎性体，结果显示研究组患者中的NLRP3蛋白表达以及CASP1蛋白表达均显著下降，提示NLRP3的蛋白表达与mRNA表达比较一致，表明NLRP3在类风湿关节炎患者的炎症进展中有负性调控影响，同时CASP1基因的mRNA表达与蛋白表达结果相反，具体機制还需要后续深入研究[13]。有研究人员发现PYCARD的蛋白表达明显上升，表明PYCARD所影响的NLRP3炎性体在类风湿关节炎患者的炎症反应中有重要的作用[14，15]。

综上所述，研究NLRP3炎性体在类风湿关节炎患者中的表达及关联因子特点的改变，对诊断患者的病情、评估患者的预后质量均有重要的应用价值[16-20]。不过当前情况下，NLRP3炎性体方面的研究仍然处于初步发展的阶段，后续需要深入研究NLRP3炎性体相关功能。

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（收稿日期：2017-01-25）