他汀类药物对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症及黏液高分泌的作用及机制

柳国洪 于洪江

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)

他汀类药物对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症及黏液高分泌的作用及机制

柳国洪 于洪江

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)

目的 探讨他汀类药物对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠气道炎症及黏液高分泌的作用及机制。方法 通过烟熏和气管注入脂多糖建立大鼠COPD模型。将21只SD大鼠随机分为对照组、COPD组、辛伐他汀组，每组7只。对照组、COPD组每日用生理盐水灌胃1次，剂量为1 ml/100 g；辛伐他汀组每日用0.5 g/L的辛伐他汀溶液按1 ml/100 g剂量灌胃1次。检测大鼠肺功能指标，苏木素-伊红(HE)染色观察支气管和肺组织的病理变化；酶联免疫吸附法(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)上清液中细胞因子白细胞介素(IL)-8、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量；免疫组化法检测肺组织中核转录因子(NF)-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、Toll样受体(TLR)4的表达；Western印迹和RT-PCR检测肺组织黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA的表达。结果 辛伐他汀组大鼠肺功能指标明显高于COPD组，低于对照组(P<0.01)；辛伐他汀组大鼠病理学改变较COPD组明显减轻。COPD组大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明显高于辛伐他汀组和对照组，辛伐他汀组明显高于对照组(P<0.01)。COPD组、辛伐他汀组大鼠肺组织中NF-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、TLR4水平均明显高于对照组而低于COPD组(P<0.01)。COPD组大鼠组织黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA表达量均明显高于对照组，辛伐他汀组明显低于COPD组(P<0.01)；辛伐他汀组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 辛伐他汀可有效降低COPD大鼠的气道炎性反应，抑制气道黏液高分泌，主要通过抑制NF-κB下游信号通路和TLR4/NF-κB信号通路来实现。

辛伐他汀；慢性阻塞性肺疾病；气道炎症；气道黏液高分泌

慢性阻塞性肺疾病(COPD)多发于老年人群〔1〕。近年来气道炎症和黏液高分泌在COPD发病中的作用成为研究热点之一；气道中炎性细胞浸润可增加黏液分泌量，进而加重炎症反应，被认为与COPD病情进展密切相关〔2〕。他汀类药物是中国治疗心血管疾病的一线药物，但其在调节血脂之外还有抗感染、调节细胞凋亡等作用〔3〕。本研究旨在探讨他汀类药物对COPD气道炎症和黏液高分泌的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物和材料 雄性SD大鼠21只，7～10周龄，体质量180～220 g，购于长春高新医学动物实验研究中心，批号：SCXK(吉)2003004。辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司，国药准字H19990366)；脂多糖，酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(北京中生瑞泰科技有限公司)；大鼠核转录因子(NF)-κB单克隆抗体，大鼠黏蛋白5AC单克隆抗体(上海蜜骏生物科技有限公司)；兔抗大鼠黏附分子1、Toll样受体(TLR)4多克隆抗体(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理 大鼠适应性喂养1 w后随机分为对照组、COPD组、辛伐他汀组，每组7只。按照文献的方法建立大鼠COPD模型〔4〕。对照组、COPD组用1 mg/100 g生理盐水灌胃，1次/d；辛伐他汀组用0.5 g/L的辛伐他汀溶液按1 ml/100 g剂量灌胃，1次/d，辛伐他汀给药量按成年人用量0.5 mg/kg每日换算大鼠给药量，是临床用量的10倍。分别在第29、42天腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后，用静脉套管针插入大鼠气管注入100 μg/100 μl的脂多糖，第30～56天(排除第42天)上午均将大鼠放入密封烟室中，连续吸入香烟烟雾45 min，1次/d，20支/次，对照组除外。3组大鼠除烟熏外，其余时间均在相同环境喂养，第57天处死。

1.2.2 肺功能检测 使用意大利科时迈动物肺功能仪PONY FX检测。造模最后1 d，麻醉后分组将大鼠固定，切开颈部皮肤，分离皮下组织，在气管软骨间做一小切口，插入接有三通的气管插管，切口下端缝合固定后将插管另一侧接入呼吸机。测定肺活量(FVC)、0.1 s用力呼气量(FEV0.1)、呼气峰值流速(PEF)。

1.2.3 肺组织病理学检查和细胞因子含量测定 肺功能测完后打开胸腔，切取2叶左肺，冻存待测。用注射器将5 ml生理盐水注入气管，反复抽吸3次后回收支气管肺泡灌洗液(BALF)，反复操作3次，收集BALF约8 ml，1 000 r/min离心20 min，收集上清，冻存待测。取出右肺，经10%甲醛固定后，石蜡包埋，0.4 μm连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，免疫组化法观察组织病理学改变。ELISA法检测BALF上清液中细胞因子白细胞介素(IL)-8、IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量，操作按试剂盒说明书进行。

1.2.4 免疫组化检测 采用免疫组化SP法检测大鼠肺组织中NF-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、TLR4表达水平。取右下肺组织切片，按试剂盒说明，分别加入相应一抗的浓度均为1∶500，冷藏过夜，加二抗，37℃孵育30 min；二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察；IPP分析软件测定阳性细胞的吸光度。

1.2.5 Western印迹检测 Western印迹法检测肺组织中黏蛋白5AC、TLR4的蛋白表达水平，取收集的左肺组织100 mg，蛋白裂解后1 200 r/min离心15 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测蛋白浓度。将获取的蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，将目标蛋白湿法转移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，分别滴加鼠抗人黏附分子5AC单克隆抗体、鼠抗人TLR4单克隆抗体，4℃过夜，磷酸缓冲液(PBS)洗涤后滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温下封闭2 h，PBS洗涤后使用化学发光增强法(ECL)发光试剂盒检测蛋白水平，软件分析条带灰度值，以β-actin为内参计算目的条带的相对比值。

1.2.6 RT-PCR检测 取左肺组织100 mg，Trizol法提取总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA。反应体系共10 μl(SYBR Green 荧光定量染料5 μl、上游和下游引物各1 μl、cDNA 1 μl、蒸馏水2 μl)。常规反应条件下共进行40个循环，引物由上海依赫生物科技有限公司。使用2-△△Ct法计算定量结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS15.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 3组大鼠肺功能指标比较 辛伐他汀组大鼠肺功能明显高于COPD组，低于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠肺功能指标比较

与对照组比较：1)P<0.01；与COPD组比较：2)P<0.01；下表同

2.2 3组大鼠肺组织病理学改变 对照组无支气管壁增厚和炎性细胞浸润，肺泡组织结构完整，无纤毛脱离。COPD组支气管壁增高，血管周围存在炎性细胞浸润，肺泡组织壁变薄，相互融合，明显纤毛脱落、倒伏，符合COPD的病理表现。辛伐他汀组支气管壁厚度轻度增加，管腔局部变形，血管周围轻度炎性细胞浸润，肺泡组织部分纤毛脱落、倒状。见图1。

图1 3组大鼠肺组织病理学变化(HE，×200)

2.3 3组大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α水平比较 COPD组大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明显高于辛伐他汀组和对照组，辛伐他汀组明显高于对照组(P<0.01)。见表2。

2.4 3组大鼠肺组织NF-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、TLR4表达水平比较 COPD组、辛伐他汀组大鼠肺组织中NF-κB、黏附分子1、黏蛋白5AC、TLR4水平均明显高于对照组而明显低于COPD组(P<0.01)。见表3。

表2 3组大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α水平比较

表3 3组大鼠肺组织中检测指标比较±s,n=7)

2.5 3组大鼠肺组织黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA表达水平比较 COPD组大鼠组织黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA表达量均明显高于对照组，辛伐他汀组明显低于COPD组(P<0.01)；辛伐他汀组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 3组大鼠肺组织黏蛋白5AC、TLR4蛋白和mRNA表达量比较

3 讨 论

本研究中采用烟熏结合气管输注脂多糖来大鼠COPD模型，并提示造模成功，且结果说明辛伐他汀可能对COPD具有防治作用。

黏附分子1多由血管内皮细胞和支气管上皮细胞分泌，其高表达与COPD气道炎性细胞增加和黏液大量生成有关。NF-κB是一种具有多种调节作用的因子，可在基因水平上调控多种炎性介质，自身也能够将NF-κB激活，进而提升炎性反应介质相关基因表达，产生级联效应〔5〕。本研究结果提示辛伐他汀可通过抑制NF-κB的活性使下游信号通路的活性丧失，减少炎性介质的分泌，改善COPD的气道炎性反应。

TLR4是一种病原识别受体，脂多糖与其结合可激活Toll样受体，使NF-κB通路开放，促进炎性因子的大量释放〔6〕。相关研究显示，黏蛋白5AC高分泌与TLR4/NF-κB信号通路的高表达有关〔7〕。本研究结果说明辛伐他汀可有效治疗COPD大鼠气道黏液的高分泌作用，主要通过降低TLR4表达来抑制TLR4/NF-κB信号通路的活性，进而降低黏蛋白5AC表达水平来实现。

1 洪秀琴，戴爱国，孔春初，等.湖南部分地区慢性阻塞性肺疾病流行现状调查〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(4)：795-7.

2 Reed RM,Scharf S.Increased adverse events after percutaneous coronary intervention in patients with COPD〔J〕.Chest，2012；141(3)：828-9.

3 王 伟.辛伐他汀对COPD气道炎症和细胞凋亡的影响及其机制研究〔D〕.苏州：苏州大学，2012.

4 Wang MT，Lo YW，Tsai CL，etal.Statin use and risk of COPD exacerbation requiring hospitalization〔J〕.Am J Med，2013；126(7)：598-606.

5 谭裕尧.高原地区慢阻肺急性加重期合并慢性肺心病抗氧化治疗疗效分析〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；15(3)：348-51.

6 Moy ML，Teylan M，Weston NA，etal.Daily step count is associated with plasma c-reactive protein and IL-6 in a US Cohort with COPD〔J〕.Chest，2014；145(3)：542-50.

7 Reed RM，Iacono A，De Filippis A，etal.Statin therapy is associated with decreased pulmonary vascular pressures in severe COPD〔J〕.COPD,2011；8(2)：96-102.

〔2016-12-21修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

吉林省教育厅“十二五”规划项目(No.20140126)

柳国洪(1969-)，男，副教授，主要从事内科学研究。

R563

A

1005-9202(2017)09-2117-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.015