Akt信号通路在非典型性抗精神病药物阿立哌唑调节海马神经细胞凋亡中的作用

吕 路 梅 蕊 彭 樊 王 昉 王 婧

(武汉市精神卫生中心医务处，湖北 武汉 430022)

Akt信号通路在非典型性抗精神病药物阿立哌唑调节海马神经细胞凋亡中的作用

吕 路 梅 蕊 彭 樊1王 昉2王 婧3

(武汉市精神卫生中心医务处，湖北 武汉 430022)

目的 探讨非典型性抗精神病药物阿立哌唑是否通过Akt信号通路对海马神经细胞的凋亡发挥作用。方法 通过构建精神分裂症(CPZ)模型小鼠，设置对照组、阿立哌唑组、CPZ组、CPZ+阿立哌唑四组，实验结束后对小鼠断头取脑，冰上分离出海马组织和脊髓，培养海马神经细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，MTT检测细胞增殖、Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1的表达情况；使用磷酸化Akt信号通路试剂盒对总Akt,磷酸化Akt(Ser473)含量的变化情况进行检测。结果 对饲养6 w后的小鼠提取海马神经细胞，流式细胞仪、MTT检测结果表明，建立CPZ模型的小鼠，在饲养过程中使用阿立哌唑能明显降低海马神经细胞的凋亡率；MTT检测结果表明，与对照组相比，使用阿立哌唑的CPZ模型小鼠海马神经细胞的存活率明显提高(P<0.01)；Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1的结果表明，构建的CPZ模型小鼠脊髓受到一定程度损伤，Beclin1的表达量明显升高(P<0.01)，给阿立哌唑后其表达量显著下降；在CPZ组中总Akt及Ser473的表达水平均显著下降(P<0.01)，通过服用阿立哌唑后表达水平出现回升，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。结论 非典型性抗精神病药物阿立哌唑可通过Akt信号通路使海马神经细胞免于凋亡。

阿立哌唑；Akt信号通路

抑郁症主要是由于认知与现实的不协调造成的，其症状的轻重程度与环境及受教育程度密切相关〔1,2〕。目前，药物治疗仍作为该病的首选方式〔2〕。与传统抗精神病药物相比，非典型性抗精神病药物疗效好，副作用小，已被广泛应用于临床治疗〔3〕。磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白酶B(PI3K/Akt)信号通路作为一种促生存信号通路，其激活对神经细胞的保护具有重要作用，从而起到缓解抑郁症状的作用〔4〕。本研究通过构建精神分裂症(CPZ)模型小鼠，观察非典型性抗精神病药物阿立哌唑是否通过PI3K/Akt信号通路发挥抗抑郁症的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及动物模型的制备 实验所用小鼠均购自武汉大学实验动物中心，6～7周龄，体重(18±2)g。购买之后常规饲养7 d，饲养环境的温度约23.5℃、湿度控制在40%～60%。

动物模型的制备:采用0.2%质量浓度的 cuprizone 连续给药6 w构建CPZ。具体制作方法：将CPZ按照0.2%的添加量与饲料混匀，用自来水使之混合凝结成团状，用模具制成圆柱状小鼠颗粒饲料，于阴凉通风处烘干，使用该饲料饲喂小鼠6 w即可。

1.2 实验药物 阿立哌唑。

1.3 主要仪器和试剂 胎牛血清(北京索莱宝科技有限公司),RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),蛋白质提取试剂盒(上海纯优生物科技有限公司),BCA蛋白质浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),反转录试剂盒(宝生物工程有限公司),实时定量PCR试剂盒(上海信帆生物科技有限公司),磷酸化Akt信号通路试剂盒(Cell Signaling),Annexin-V-FTTC-P1试剂盒(美国Coulter),MTT(美国Invitrogen),流式细胞仪(美国Coulter),离心机(Eppendorf),CO2培养箱(长沙长锦生物科技有限公司),超净工作台(无锡云洁净化设备有限公司),倒置显微镜(日本尼康),荧光素酶分析仪(北京普力特仪器有限公司),离心机(德国Sorvall)。

1.4 实验分组 分为对照组、阿立哌唑组、CPZ组、CPZ+阿立哌唑组，其中对照组常规饲养，阿立哌唑组在常规饲养过程中通过饮水饲喂阿立哌唑，CPZ组在建模过程中饲喂0.2%质量浓度的CPZ；CPZ+阿立哌唑组在建模过程中饲喂0.2%质量浓度的CPZ，同时饮水服用阿立哌唑(10 mg/d)。实验周期为6 w。

1.5 海马细胞培养 6 w后，分别对各组小鼠断头取脑，冰上分离出海马组织，0.25%的胰酶对海马组织消化15 min，并吹打均匀，制成单细胞悬液。随后对单细胞悬液进行过滤，细胞计数后分装入含有10%胎牛血清的培养瓶中，37℃饱和湿度、5%CO2条件下进行常规传代培养。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 0.25%的胰蛋白酶消化收集海马细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后加入5 μl膜联蛋白(Annexin V)，室温条件下孵育10～15 min后加入5 μl 7-AAD，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 MTT检测细胞增殖情况 收集处于对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔细胞培养板中过夜培养至48 h。加入MTT溶液10 μl(5 mg/ml)，37℃培养4 h，加入二甲基亚砜(DMSO)溶液100 μl震荡，待沉淀完全溶解后置于酶标仪测定OD值。

1.8 Western印迹检测Akt信号通路的变化 通过使用磷酸化Akt信号通路试剂盒对总Akt,磷酸化Akt(Ser473)含量的变化情况进行检测，分别对其总蛋白进行提取，提取方法参照说明书进行。将蛋白样品与上样缓冲液以3∶1的比例混合，100℃煮沸5 min，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)检测。电压采用先低后高的趋势，以保证条带的质量，当Marker迁移至分离胶底部时终止电泳。取出凝胶在4℃条件下转膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗4℃孵育过夜，Trist盐酸缓冲液(TBST)洗涤后与兔抗小鼠二抗室温孵育1 h。用增强化学发光法(ECL)显影后成像。

1.9 Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1的表达 6 w后采用颈部处死的方式，分别取出各组小鼠的脊髓：快速暴露损伤部位的脊髓，在无菌条件下取出小块损伤的脊髓并置于液氮中保存。随后参照蛋白提取试剂盒说明书，分别对各组的脊髓相关蛋白Beclin1进行提取，采用紫外分光光度计测定蛋白含量，并通过Western印迹进行检测。

1.10 统计学方法 应用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 流式细胞仪检测海马神经细胞的凋亡情况 建立CPZ模型小鼠，在饲养过程中使用阿立哌唑能明显降低海马神经细胞的凋亡率；而在对照组和阿立哌唑组效果不显著。见图1。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

2.2 MTT检测细胞增殖情况 对照组〔(78.16±4.64)%〕和阿立哌唑组〔(79.82±6.31)%〕海马细胞存活情况大致一致，差异无统计学意义(P>0.05)；但CPZ模型小鼠海马神经细胞的存活率〔(29.64±2.56)%〕明显下降，服用阿立哌唑后细胞存活率〔(62.47±1.64)%〕明显升高(P<0.01)。

2.3 Beclin1的表达情况 构建的CPZ模型的小鼠脊髓受到一定程度损伤，Beclin1表达量明显升高(对照组为0.53±0.05,CPZ组为0.84±0.06，阿立哌唑组为0.52±0.04，P<0.01)，给予阿立哌唑后表达量(0.46±0.07)显著下降，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 Western印迹检测Akt信号通路的变化情况 总Akt 及Ser473表达水平的变化情况基本一致，CPZ组中两者的表达水平(0.63±0.08，0.79±0.06)均显著下降(P<0.01)，服用阿立哌唑后表达水平出现回升(1.75±0.17，1.48±0.10)，与对照组(1.62±0.11,1.73±0.13)相比差异无统计学意义(P>0.05)。阿立哌唑组总Akt、Ser473表达量分别为2.25±0.16，1.94±0.12。

3 讨 论

非典型性抗精神病药物作为治疗抑郁症的首选，治疗效果较好，且副作用小，具有很好的应用前景〔5～7〕，其作用机制为：(1)可能限制了黑质纹状体通路的5-羟色胺(5-HT)2A受体，使纹状体D2受体功能的选择性得以改善，并通过阻断中脑皮层通路，增加了前额皮层的D1 受体功能。(2)通过阻断中脑边缘系统的D2 受体,调节多巴胺功能亢进,使注意力得到改进。阿立哌唑是首个用于治疗抑郁症的D2 受体拮抗剂，主要是通过拮抗多巴胺D2 受体的活性进行介导的。前期研究结果表明，在CPZ患者中，阿立哌唑较氯丙嗪的治疗效果好〔8〕。研究报道〔9〕，抑郁症患者中，海马神经元明显减少，进一步研究证实，重症CPZ患者的海马体积显著缩小，推测这与海马神经元的凋亡密切相关。PI3K/Akt信号通路在细胞中广泛存在，主要参与细胞的分化、增殖、凋亡等过程，作为一种促生存信号通路，其激活对神经细胞的保护具有重要作用〔10〕。Akt即蛋白激酶B，作为PI3K的靶蛋白之一，其特异性与底物中丝氨酸(苏氨酸)残基相互作用，使其磷酸化，从而在蛋白质的相互作用间起作用。Ser-473作为主要的磷酸化位点，其表达量的升高预示着PI3K/Akt信号通路的激活，从而保护细胞免于凋亡。本研究结果表明，对CPZ模型的小鼠使用阿立哌唑后，总Akt及Ser-473的表达量明显回升。后续对海马细胞的凋亡情况及细胞存活率研究表明，与CPZ组的小鼠相比，服用阿立哌唑的CPZ模型组的小鼠，海马细胞的存活率明显提高、凋亡率明显降低。提示阿立哌唑可通过激活PI3K/Akt信号通路，从而使海马神经细胞免于凋亡。

抑郁症患者会伴随不同程度的脊髓损伤，脊髓损伤会导致自噬现象的发生，而自噬在海马神经细胞的发生发展过程中发挥中药作用，可作为细胞的保护机制，防治细胞凋亡〔11〕。Beclin1作为一种自噬相关蛋白，能够促进自噬的发生，且在脊髓损伤后Beclin1的表达量显著增高〔12〕。Beclin1在神经元和胶质细胞中呈现高表达，这在一定程度上促进了自噬现象的激活，这对细胞凋亡的抑制具有促进作用。本研究表明阿立哌唑对抑郁症的小鼠具有一定的缓解作用。由于本文仅研究单一的非典型性抗精神病药物通过Akt信号通路对海马神经细胞的作用，但就其一类药物中的其他药物是否都是通过Akt信号通路发挥作用及其具体的作用机制还有待深入研究。

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3 Nasr S,Wendt B,Popli A,etal.Comparing outcomes of adjunctive treatment in depression:aripiprazole versus bupropion〔J〕.J Affect Disord,2014;162(3):50-4.

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11 黄 蓉,韦 曦.自噬效应蛋白Beclin1的研究进展〔J〕.中外医学研究,2011;9(28):159-61.

12 Kuo SY,Castoreno AB,Aldrich LN,etal.Small-molecule enhancers of autophagy modulate cellular disease phenotypes suggested by human genetics〔J〕.Proceed Nat Acad Sci,2015;112(31):E4281-7.

〔2016-11-22修回〕

(编辑 袁左鸣)

湖南省自然科学基金(No.2015JJ1010)

王 昉(1980-)，女，主治医师，主要从事精神疾病方面研究。

吕 路(1978-)，男，主治医师，主要从事精神疾病方面研究。

R749.05

A

1005-9202(2017)09-2110-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.012

1 武汉市中医医院院办 2 武汉市精神卫生中心司法鉴定科

3 武汉市精神卫生中心综合科