内皮素-1在红藻氨酸致癫痫大鼠海马区的表达及依达拉奉的干预作用

齐宝奎 臧兆萍 李志茹 刘忠锦 杨晓华 高巍巍

(齐齐哈尔医学院第一附属医院神经内科，黑龙江 齐齐哈尔 161041)

内皮素-1在红藻氨酸致癫痫大鼠海马区的表达及依达拉奉的干预作用

齐宝奎 臧兆萍 李志茹 刘忠锦 杨晓华 高巍巍

(齐齐哈尔医学院第一附属医院神经内科，黑龙江 齐齐哈尔 161041)

目的 观察内皮素(ET)-1在红藻氨酸(KA)致癫痫大鼠海马的表达及依达拉奉对其影响。方法 50只雄性 Wistar大鼠被随机分成5组，每组10只。正常组、磷酸盐缓冲液(PBS)组、癫痫组，治疗组1(地西泮治疗)，治疗组2(地西泮+依达拉奉治疗)。癫痫组在大鼠右侧海马以每公斤体重注射 1.5 μg/μl KA，PBS组采取同样的方法在相同部位注入等量PBS，治疗组1在癫痫模型成立后给予10 mg/kg地西泮终止癫痫，治疗组2在治疗组1的基础上1 h后再给予依达拉奉30 mg，1次/12 h，正常组不注射任何药物。结果 激光共聚焦显微镜观察，癫痫组ET-1的表达密度显著高于PBS组及正常组(P<0.05)，治疗组较正常组、PBS组及癫痫组表达显著下降(P<0.05)，治疗组1较治疗组2表达显著增高(P<0.05)。十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示ET-1的相对分子质量为2 492 D，其在癫痫组的表达较正常组及PBS组显著增加，治疗组较癫痫组显著降低(均P<0.05)，与激光共聚焦的结果相一致。结论 ET-1表达增加对癫痫后大鼠海马的神经元损伤具有细胞保护作用。

癫痫；内皮素(ET)-1；红藻氨酸

癫痫是一种神经元发作性异常放电所引起的以反复痫样发作的临床症候群，病因复杂，发病机制尚未阐明，研究发现30%～70%癫痫患者存在认知功能障碍〔1，2〕。依达拉奉可清除自由基、抑制兴奋性神经递质谷氨酸的释放。体内许多组织中均有内皮素(ET)分布，如血管平滑肌、心、脑神经组织等，ET作为细胞内信使在中枢神经系统(CNS)多种应激状态下可大量释放，从而发挥调节功能。本实验旨在研究癫痫状态下损伤神经元的ET-1的释放表达及依达拉奉对其表达影响及其在颞叶癫痫发生及治疗中的可能作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠50只，健康、雄性、清洁级，体重200～250 g，环境温度适宜，实验过程遵守中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》的规定。

1.2 癫痫大鼠模型的建立 随机分成正常组、磷酸盐缓冲液(PBS)组、癫痫组，治疗组1(地西泮治疗组)，治疗组2(地西泮+依达拉奉治疗组),每组10只。将Wistar大鼠用10%水合氯醛1 ml(0.3～0.4 ml/kg体重)麻醉后固定，备皮，切开，剥离，按大鼠脑立体定向图谱，以前囟为靶点定位CA3〔坐标：X=2.5 mm(右)，Y=3.0 mm，Z=3.5 mm〕钻孔，将浓度为1.5 μg/μl红藻氨酸(KA)(以PBS配制)1 μl，于无菌的条件下注入。注药持续10～15 min，留针5 min。癫痫鼠模型的判定依据行为学改变。PBS组于相同部位等时注入等量的PBS。以Racine等〔3〕行为学标准判定癫痫模型。

1.3 标本的制备 标本固定，包埋，切片，脱蜡，抗原修复，封闭，兔抗鼠ET-1抗体 (单克隆抗体)以1∶100的比例稀释后于冰箱4℃孵育过夜，次日将切片室温复温1 h，反复3次PBS漂洗，滴加山羊抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)标记荧光二抗(浓度1∶50)，2.5 μg/ml碘化丙啶(PI)染色20 min后漂洗水化封片。从加荧光二抗开始的双重标记实验过程均需避光操作。所采用的双标法有参照Bernardini等〔4〕方法。

1.4 共聚焦激光扫描显微镜检测与数据分析 所用仪器为奥林巴斯LSM510 META共聚焦激光扫描生物显微镜。能同时激发波长为488 nm和514 nm可见光激光光源，发射波长分别为516 nm与617 nm，两者无交叉重叠区域，这种区分是进行双重标记和观察的前提。每张切片随机取10个视野，连续扫描10个层面。将数字化图像存储进行图像数据分析。

1.5 蛋白质印迹分析 提取细胞总蛋白，酶标仪测总蛋白含量，样品与5倍上样缓冲液为4∶1，煮沸5 min使蛋白变性。步骤为：制备12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，取60 μg 总蛋白上样，电泳30 min；室温、恒压220 V条件下，湿转移法转膜〔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜〕30 min。37℃于封闭液中封闭2 h；封闭液以吐温磷酸盐缓冲液(PBST)配制加5%脱脂奶粉，ET-1抗体(1∶50)4℃冰箱孵育过夜；反复吐温Tris-缓冲盐溶液(TBST)漂洗3次，10 min/次；加入辣根过氧化物酶(HRP)-抗兔IgG(1∶8 000)于室温摇床中孵育2 h，反复TBST 洗3次，每次5～10 min；电化学反应(ECL)反应30 min后，暗室中X线片曝光；室温显影、定影。用凝胶图像系统(GIS)凝胶成像系统对胶片进行薄层密度扫描，记录相应条带的透射光积分光密度(IOD)值反映蛋白含量。β-actin为内参。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 免疫印迹法癫痫组海马CA3区蛋白的表达 癫痫组ET-1表达显著高于正常组(P<0.05)。见图1。

1.正常组，2.PBS组，3.癫痫组，4.治疗组1，5.治疗组2 图1 ET-1在大鼠海马CA3区的表达

2.2 各组海马CA3区蛋白的表达 当开检测通道为488 nm时，仅显示被染成绿色荧光的光斑(图2中1、4、7、10、13)，而当开检测通道为514 nm时，仅显示被染成红色的核酸(图2中2、5、8、11、14)，这样更加清楚地显示了细胞核的轮廓，当细胞核PI标记的核酸红色与细胞外FITC标记的荧光二抗绿色叠加时，更能突显细胞质中所观测蛋白的表达(图2中3、6、9、12、15)。在CA3区，ET-1的表达密度癫痫组(4.08±0.30)显著高于正常组(0.98±0.03)及PBS组(1.04±0.04)，治疗组显著低于癫痫组，治疗组1(2.01±0.22)显著高于治疗组2(1.30±0.15)(均P<0.05)。

1～3为正常组，4～6为PBS组，7～9为癫痫组，10～12为治疗组1，13～15为治疗组2 图2 免疫荧光双染法测ET-1在各组大鼠海马的表达(×200)

3 讨 论

KA致癫模型已得到广泛认可，具有很强神经毒性的KA作为谷氨酸类似物的一种，可人工提取，它可与非N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合，此种作用发生于神经元突触后膜上。目前认为兴奋性氨基酸的堆积和海马神经元兴奋性氨基酸受体的上调是KA诱导痫性发作的主要分子机制〔5〕。海马 CA3区神经元死亡、胶质细胞增生和苔状纤维发芽是海人酸颞叶癫痫模型一个显著的病理特点，这样的病理改变同人类颞叶癫痫的病理改变与海马硬化相一致〔6〕。

ET-1作为ET家族中的一员，是目前已知的最强的缩血管肽，是CNS一个重要的神经递质和神经肽，它可与其受体结合，激活鸟苷酸环化酶，促进细胞内钙离子释放，并通过Na+/ Ca2+交换机制，使细胞内游离钙离子浓度增加。研究表明钙通道参与癫痫形成〔7～9〕，Ca2+过度内流所致钙通道异常，从而脑神经元的过度、同步放电，致其发作。癫痫患者钙通道异常，致Ca2+过度内流，神经元异常放电，采用地西泮及依达拉奉的联合治疗致ET-1的表达改变，从而干预钙通道，而对异常放电的神经元起到保护作用。其可能的作用机制是依达拉奉可降低谷氨酸的兴奋性，而二者的联合使用是序贯使用，不是混合应用，故不考虑二者混合应用会对大鼠造成不良反应，实验也证实二者的联合应用不受此影响。至于依达拉奉清除自由基的作用是否起到此作用，有待研究确定。依达拉奉可清除羟自由基，对脑神经元具有保护作用(约60%可以透过血脑屏障)，其可抑制谷氨酸释放，且可拮抗氧自由基，也可抑制脂质过氧化。依达拉奉为小分子，静脉用药能够在脑内到达有效治疗浓度〔10，11〕。神经科中已广泛应用依达拉奉注射液的羟自由基清除剂功能〔12〕。 Kamida 等〔10〕究发现依达拉奉在癫痫中所起的保护作用是通过降低诱导型一氧化氮合酶的表达而减少癫痫持续状态后海马神经细胞凋亡而实现的。

1 Helmstaedter C，Kockelmann E.Cognitive outcomes in patients with chronic temporal lobe epilepsy〔J〕.Epilepsia，2006;47：96-8.

2 Pulliainen V，Kuikka P，Jokelainen M.Motor and cognitive functions in newly diagnosed adult seizure patients before antiepileptic medication〔J〕.Acta Neurol Scand，2000;101：73-8.

3 Racine RJ，Steingart M，McIntyre DC.Development of kindling-prone and kindling-resistant rats：selective breeding and electrophysiological studies〔J〕.Epilepsy Res，1999；35(3)：183-95.

4 Bernardini G，Ribatti D，Spinetti G，etal.Analysis of the role of chemokinesin angiogenesis〔J〕.J Immunol Method，2003；273(1-2)：83-101.

5 Loscher W，Lehmann H，Behl B，etal.A new pyrrolyl-quinoxalinedione serious of non.NMDA glutamate receptor antagonists：pharmacological characterization and comparison with NBQX and valproate in the kindling model of epilepsy〔J〕.Eur J Neurosci，1999；11：250-62.

6 杨忠旭，栾国明，阎 丽，等.颞叶癫痫大鼠模型的建立及长期癫痫敏感性的研究〔J〕.中华医学杂志，2004;84(2)：152-5.

7 Zamponi GW，Lory P，Perez-Reyes E.Role of voltage-gated calcium channels in epilepsy 〔J〕.Pflugers Arch，2010;460(2)：395-403.

8 Li H，Graber KD，Jin S，etal.Gabapentin decreases epilepti-form discharges in a chronic model of neocortical trauma 〔J〕.Neurobiol Dis，2012;48(3)：429-38.

9 Faria LC，Parada I，Prince DA.Interneuronal calcium channel abnormalities in posttraumatic epileptogenic neocortex 〔J〕.Neurobiol Dis，2012;45(2)：821-8.

10 Kamida T，Abe E，Abe T，etal.Edaravone，a free radical scavenger，retards the development of amygdala kindling in rats〔J〕.Neurosci Lett，2009;461(3)：298-301.

11 Miyamoto R，Shimakawa S，Suzuki S，etal.Edaravone prevents kainic acid-induced neurol death 〔J〕.Brain Res，2008;13(1209)：85-91.

12 郑瑞强，陈齐红，林 华，等.血必净注射液对急性呼吸窘迫综合征患者免疫功能及预后影响的多中心随机对照临床研究〔J〕.中国中西医结合急救杂志，2012;19(1)：21-3.

〔2015-03-25修回〕

(编辑 苑云杰)

黑龙江省自然科学基金资助项目(No.H201498)

臧兆萍(1979-)，女，主治医师，硕士，主要从事癫痫研究。

齐宝奎(1969-)，男，副主任医师，主要从事脑血管病与癫痫研究。

R742.1

A

1005-9202(2017)09-2105-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.010