降压宝蓝片含药血清对大鼠血管成纤维细胞增殖及表型转化的影响

梁瑞峰 李开言 王晓丽 张雪侠 王 军

(河南省中医药研究院中药研究所，河南 郑州 450004)

降压宝蓝片含药血清对大鼠血管成纤维细胞增殖及表型转化的影响

梁瑞峰 李开言 王晓丽 张雪侠 王 军

(河南省中医药研究院中药研究所，河南 郑州 450004)

目的 观察降压宝蓝片含药血清对大鼠血管紧张素Ⅱ诱导的成纤维细胞增殖及转化的影响。方法 原代培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞，分为空白组、模型组、降压宝蓝片含药血清低、中、高浓度组(体积分数为5%、10%、15%)。用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性，羟脯氨酸法检测胶原含量，酶联免疫吸附(ELISA)法检测转化生长因子(TGF)-β1含量，免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达情况。结果 与模型组相比，降压宝蓝片含药血清高浓度组细胞增殖、胶原、TGF-β1分泌、α-SMA表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，中浓度组细胞增殖、TGF-β1含量显著降低(P<0.05)。结论 降压宝蓝片含药血清可抑制成纤维细胞增殖和表型转化。

含药血清；成纤维细胞；增殖；表型转化

血管重构是高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的共同病理生理过程，对其研究以往主要集中于内膜内皮细胞和中膜平滑肌细胞，近年来研究表明，血管重构主要是基于外膜的病理过程〔1〕，血管损伤后血管成纤维细胞(AFs)向肌成纤维细胞(MFs)的转化是这一过程的关键事件〔2〕。转化生长因子(TGF)-β1是病理性血管重构过程中重要的因子，其能够促进AFs过度增殖，诱导AFs向MFs转化，上调α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及胶原的表达〔3〕。AFs的增殖及表型转化在血管重构的发生发展中扮演着重要角色，抑制AFs增殖和表型转化对改善病理性血管重构具有重要意义。降压宝蓝片主要用于肝火亢盛型高血压的治疗，临床疗效确切，动物试验表明降压宝蓝片可以改善自发性高血压大鼠的血管重构〔4〕。本实验通过观察降压宝蓝片含药血清对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的AFS增殖及表型转化的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠，雄性，体重180～200 g，购自河南省实验动物中心，合格证号SCXK(豫)2010-0002。

1.2 药物与试剂 降压宝蓝片，河南省中医药研究院附属医院制剂室提供，批准文号：豫药制字Z20121056，批号20130404；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司；AngⅡ购自Sigma公司；羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物公司；TGF-β1试剂盒、α-SMA单克隆抗体、SABC试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 主要仪器 全功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；细胞培养箱(美国Forma Scientific公司)；2K15型冷冻离心机(Sigma公司)；倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 含药血清制备 20只SD大鼠随机分为空白组和降压宝蓝片组，每组10只。按体表面积法换算动物的等效剂量，降压宝蓝片组给予降压宝蓝片0.9 g·kg-1·d-1(等效剂量的5倍)，空白组给予相同体积的蒸馏水，灌胃给药，每天1次，连续7 d，末次给药后2 h，麻醉腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min分离血清，56℃水浴灭活30 min，0.22 μm过滤除菌，-20℃保存备用〔5〕。

1.4.2 细胞培养 SD大鼠麻醉，取胸主动脉，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，眼科剪纵向剪开血管，血管内膜面朝上铺于培养皿上，用眼科弯镊轻轻刮去内膜，然后固定血管一端，用眼科弯镊剥离中膜，余下外膜，PBS漂洗1次，将外膜置于含20%胎牛血清的DMEM培养液中，剪成1 mm2组织块，平铺于25 ml培养瓶底，翻转使瓶底在上，贴壁培养4 h，添加含20%胎牛血清的DMEM培养液3 ml，小心翻转培养瓶使组织块浸于DMEM 培养基中继续培养。5～7 d后待细胞达70%融合时胰酶消化传代，第3～6代细胞用于试验。

1.4.3 实验分组 实验设空白组(体积分数为15%的空白血清)、模型组(15%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)、降压宝蓝片低浓度组(5%降压宝蓝片血清+10%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)、中浓度组(10%降压宝蓝片含药血清+5%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)及高浓度组(15%降压宝蓝片含药血清+10-6mol/L AngⅡ)，每组均设6个复孔。

1.4.4 MTT法检测细胞增殖活性 以1×105个/ml的AFs接种于96孔板中，另设6孔为阴性组(无细胞)，培养24 h后，分组处理20 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，继续孵育4 h，小心吸弃培养液，然后每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，避光震荡10 min，用酶标仪于570 nm处测定各孔的吸光度(OD)。

1.4.5 测定细胞胶原含量 细胞以1×105个/ml接种于48孔板培养24 h后，吸取0.5 ml上清液，按羟脯氨酸测试盒说明进行操作，测定细胞内胶原含量。

1.4.6 ELISA检测TGF-β1含量 细胞以1×105个/ml接种于接种于24孔板，药物作用24 h后吸取0.5 ml上清液，采用ELISA法检测细胞液中TGF-β1 含量。

1.4.7 免疫组化检测α-SMA表达 将细胞爬片置于6孔板中，按照每孔1×104个的密度接种细胞，24 h后，每组加入相应药物，培养24 h后，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗3次， 3%过氧化氢灭活10 min，山羊血清封闭10 min，加α-SMA单抗(浓度1∶100)，4℃过夜，PBS冲洗，加生物素标记的二抗，室温孵育60 min；PBS冲洗，过氧化物酶孵育60 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察，阳性细胞细胞质呈棕黄色，于镜下随机取6个非重叠视野，计算α-SMA阳性细胞百分率。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，两两比较用LSD检验。

2 结 果

2.1 AFs的培养及形态 组织块贴壁培养7 d后，开始有细胞从组织块边缘爬出(图1a)，细胞形状不规则，多呈梭形、多角形或不规则形状。原代细胞经胰酶消化后回缩、变圆，传代后生长较均匀，传至3～8代后的细胞生长最为旺盛(图1b)，5～7 d后可见细胞呈80%融合状态。

图1 AFs形态观察

2.2 降压宝蓝片含药血清对细胞活力的影响 空白组细胞活力(0.352±0.058)与模型组(0.504±0.060)相比显著增加(P<0.01)；与模型组相比，降压宝蓝片含药血清中、高浓度组(0.463±0.068，0.392±0.073)细胞增殖显著降低(P<0.05或P<0.01)，低浓度组(0.522±0.078)细胞增殖无明显变化(P>0.05)。

2.3 降压宝蓝片含药血清对各组细胞上清液中胶原、TGF-β1的影响 与空白组相比，模型组细胞培养上清液胶原、TGF-β1含量显著升高；与模型组相比，降压宝蓝片含药血清中浓度组(体积分数10%)上清液中TGF-β1含量降低(P<0.05)，降压宝蓝片含药血清高浓度组(体积分数15%)上清液胶原、TGF-β1含量显著升高(P<0.01)，见表1。

表1 降压宝蓝片含药血清对上清液中胶原、TGF-β1含量的影响

与模型组比较:1)P<0.05,2)P<0.01

2.4 免疫组化检测AFs中α-SMA蛋白的表达 空白组细胞α-SMA阳性表达为阴性，模型组阳性细胞率(18.16%)明显升高(P<0.01)。与模型组相比，降压宝蓝片含药血清低、中、高浓度组细胞阳性率(15.28%，14.02%，11.12%)显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 AFs中α-SMA蛋白的表达(DAB，×250)

3 讨 论

血管主要由内膜的内皮细胞、中膜的平滑肌细胞、外膜的AFs以及细胞外基质组成。血管重构是高血压、动脉粥样硬化、血管内膜损伤后再狭窄等多种心血管疾病发病的共同病理基础。传统的观点认为，处于血管最外层的血管外膜只对血管起支持和营养作用，近年研究表明，外膜的AFs在高血压等刺激下表型转化为MFs，其标志性蛋白是α-SMA〔6〕，细胞进而发生增殖、迁移、分泌大量细胞外基质，参与血管新生内膜的形成〔7〕。外膜AFs是血管重构的重要部位，并成为血管重构防治的新靶点〔8〕。正常的AFs缺少TGF-β1基因的表达，血管损伤后，细胞分泌TGF-β1增加，并刺激细胞增殖〔9〕。α-SMA 是MFs的标志蛋白，其表达的增加能反映静止型组织细胞向活跃型MFs的转化，通过这种转化，细胞将获得过表达细胞外基质的能力〔10,11〕。本实验显示，AngⅡ刺激后，AFs分泌的TGF-β1和胶原增加，细胞增殖明显增强，α-SMA表达，而经过降压宝蓝片含药血清干预，AFs的增殖能力下降，TGF-β1和胶原分泌减少，α-SMA表达受到抑制。

综上所述，本研究提示降压宝蓝片含药血清可能通过抑制AFs的增殖和表型转化从而改善血管重构,在防治血管重构方面发挥积极作用，但具体的分子机制尚有待进一步研究。

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〔2015-12-10修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

国家中医药管理局重点学科建设项目(国中医药发〔2009〕30号)；国家中医药管理局中医心病学重点学科基础研究课题(No.1304483)

王 军(1961-)，男，博士，研究员，硕士生导师，主要从事中药心血管药理学研究。

梁瑞峰(1983-)，男，硕士，助理研究员，主要从事中药药理及中药药性研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)09-2103-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.009