芦丁对吉富罗非鱼幼鱼组织切片及细胞凋亡的影响

郑 尧，赵志祥，史磊磊，宋 超，徐 跑，陈家长,3

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部长江下游渔业生态环境监测中心/农业部水产品质量安全环境因子风险评估实验室(无锡)，江苏 无锡 214081；2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081；3.农业部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141)

芦丁对吉富罗非鱼幼鱼组织切片及细胞凋亡的影响

郑 尧1,2，赵志祥2，史磊磊2，宋 超1，徐 跑1,2，陈家长1,2,3

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部长江下游渔业生态环境监测中心/农业部水产品质量安全环境因子风险评估实验室(无锡)，江苏 无锡 214081；2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081；3.农业部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141)

在快速生长期日粮中添加较高浓度芦丁(0、0.1和0.3 g/kg)，通过免疫、生殖器官组织切片和Tunel细胞凋亡分析，探究芦丁作为饲料免疫增强剂对吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)幼鱼组织切片及细胞凋亡的影响。结果表明低浓度芦丁会使肠道血小板增多，杯状细胞不规则；肝脏kupffer细胞少；并会造成肠道和肝脏细胞凋亡阳性率增高。高浓度芦丁组肝、脾脏出现细胞凋亡和含铁血黄素沉着；且造成肝脏和脾脏细胞凋亡阳性率增高；脾脏黑色素巨噬细胞中心少。此外，高浓度芦丁会对精巢、卵巢的发育起到抑制作用。芦丁作为水产行业免疫增强剂需慎用。

芦丁；吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)；组织切片；凋亡

芦丁(Rutin，CAS153-18-4)即维生素P、芸香苷，分子式为C27H30O16，相对分子质量为610.51，黄色结晶粉末，是一种从植物中提取的黄酮类物质。芦丁具有抗氧化，降低毛细血管脆性，提高机体免疫力等作用。芦丁能促进免疫器官(如胸腺、脾脏等)的发育[1]，对因毒物造成的肝损伤有保护作用[2-3]，利于动物器官发育并能起到免疫增强作用[4-8]。研究表明芦丁在体内和体外均有吸收[9]，在血液中以糖类等活性形式存在并发挥生物学效应[9]。芦丁广泛存在于植物中，具有较强的药理活性。国外主要用于食品、化妆品的添加剂和着色剂；芦丁也是可再生的中药资源，在中国存储量较大，国内主要将其作为畜牧业的饲料添加剂使用。国内外关于将其作为家养动物和哺乳动物的免疫增强剂的研究较多[1-5,7-8]，在水产动物上的研究较少。

罗非鱼作为世界水产业重点培育的淡水养殖鱼类，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。同时，罗非鱼也是中国主要的出口品种，2014年中国罗非鱼产量约为155万吨(占据世界总产量的40%)，其中出口40.84万吨[10]。目前为止各品系罗非鱼中，吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)具备产量高、生长迅速、抗病力强等优点。6-9月份是罗非鱼快速生长的季节，但随着温度的升高也带来链球菌病感染的风险。中草药替代抗生素能降低由于抗生素抗性给水产养殖业所带来的抗性基因转移的风险。目前为止，大黄(Rheumpalmatum)、黄芪(Astragalusmembranaceus)、金银花(Lonicerajaponica)、虎杖(Polygonumcuspidatum)、鱼腥草(Houttuyniacordata)等诸多中草药已作为水产饲料添加剂使用。同时，为了减少链球菌病给罗非鱼产业带来的损失，鱼腥草粉已经用来作为免疫增强剂添加到饲料中来起到疾病预防作用。对于其机理的研究较为少见。鱼腥草主要含黄酮类物质和挥发油[11]，由于鱼腥草粉中成分复杂，更难摸清众多活性成分中的主效成分。饲料中添加主效成分对鱼类器官的影响研究也较为少见。

前期研究表明，一般用于陆生种植的鱼腥草不仅可以用于改善罗非鱼养殖池塘水质[12-13]，还能增强罗非鱼的免疫能力[14]。在鱼腥草-罗非鱼共生浮床体系中，其根部较发达，在罗非鱼采食高峰可能被食用。鱼腥草全草中芦丁含量高达0.3%[11]，且根部芦丁含量较叶、茎组织高。关于芦丁作为畜禽饲料添加剂的正面报道较为多见[6]，若将其添加到水产鱼类饲料中，浓度过高是否会造成鱼类器官的损伤？本研究模拟快速生长期日粮添加较高浓度芦丁(0、0.1和0.3 g/kg)，通过免疫、生殖器官组织切片和Tunel细胞凋亡分析，探究芦丁对吉富罗非鱼幼鱼组织切片及细胞凋亡的影响，为吉富罗非鱼疾病防控提供基础性数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

吉富罗非鱼幼鱼(N=300)取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭养殖基地，暂养于水箱桶(1.5 t)中1个月后，从中选取体型完整、健康的个体作为试验对象，其平均体重(49.34±1.48)g，平均体长(11.73±0.24)cm。基础饲料为天邦罗非鱼1#膨化料(编号5533，蛋白含量占31.6%，脂肪含量占4.9%)。试验用水为24 h自然曝气的自来水，水温(24.8±0.8)℃，溶氧4.4～6.7 mg·L-1，pH6.3-8.1，试验期间暗光比为12 h∶12 h，试验用水符合渔业水质标准(GB11607-89)。

每个处理玻璃缸(300 L，100 cm × 65 cm × 60 cm)放置12尾吉富罗非鱼幼鱼，每个试验组作3个重复(N=108)。采用中草药粉碎机(Fw177/FW400A)将基础饲料研碎，依照预实验筛选出来的浓度结果，通过在基础饲料中添加不同浓度的芦丁(0、0.1和0.3 g/kg，芦丁购置于四川遂宁旭泰植物原料责任有限公司，纯度为98%)，每天8:00和下午4:00定量投喂各1次。试验开始前准确称量每缸鱼的重量，饲喂量所占体重比为3 %，1 h后等饲料全被吃完将粪便清除。饲喂3个月后取样(模拟吉富罗非鱼生长最佳时间段7-9月)，从每个处理组中随机挑选6尾鱼，采集肠、肝脏、脾脏浸泡于4%的甲醛溶液；采集性腺(从6-12尾鱼中选择精巢和卵巢样本各3尾以上)浸泡于Bouin′s固定液，均置于4 ℃条件下保存备用。

1.2 组织学切片

将处理好的各组织样本(肠道、肝脏、脾脏、精巢和卵巢)，经酒精梯度浓度脱水后，透明使用水杨酸甲酯试剂，莱卡RM2235制作常规石蜡切片，切片厚度为5 μm。组织切片准备好后采用Hematoxylin-eosin staining(HE)染色。使用倒置显微镜(Nikon TE2000-U)观察和拍照。在放大的电脑显示屏上设置1 cm2网格，选择3尾鱼肠道组织切片，40× 镜下统计肠道5个视野(四周和中间)血小板数量。kupffer细胞辨别方法按文献[15]对其形状和位置进行区分并统计，细胞数量统计与肠道中使用的方法相同。

1.3 Tunel试验

Tunel细胞凋亡原位检测试剂盒购置于南京建成生物科技有限公司，将肠道、肝脏和脾脏组织的石蜡切片加Triton-100通透、3%H2O2-甲醇溶液灭活、Tunel反应(每个样本滴加100 μL TdT酶反应液，避光湿润37 ℃反应1 h)、滴加100 μL Streptavadin-HRP酶标亲和素、DAB法显色、复染和封片等步骤后，选择Nikon TE2000-U倒置显微镜进行观察和拍照。凋亡细胞为棕色，正常细胞为蓝紫色，光学显微镜观察统计凋亡细胞数量，细胞凋亡指数(AI)=(凋亡细胞数÷肿瘤细胞总数)×100%。

1.4 统计学分析

采用SPSS 11.5中单因素方差分析(One-way ANOVA)处理实验数据，采用最小极差法(LSD)进行显著性检验，P<0.05视为差异显著，用不同小写字母表示。

2 结果

2.1 组织学观察结果

通过图片放大对单位面积血小板数量的统计，相比对照组肠道组织(血小板平均含量为3个/cm2，图1-1)，饲料添加芦丁组血小板增多(图1-2、3)，0.1 g/kg芦丁组血小板平均含量为6个/cm2，0.3 g/kg芦丁组血小板平均含量为5个/cm2。杯状细胞(goblet cell，gc)是混在粘膜上皮中的粘液分泌细胞，HE染色为空泡状。该研究中饲料添加芦丁组杯状细胞不规则。

与对照组相比(图1-4)，芦丁添加组肝细胞纹理变得疏松(图1-5)，出现细胞形状不规则。芦丁添加组肝细胞kupffer细胞变少，对照组kupffer细胞平均含量为6个/cm2，0.1 g/kg芦丁组kupffer细胞平均含量为4个/cm2，0.3 g/kg芦丁组kupffer细胞平均含量为3个/cm2。芦丁高浓度添加组部分肝细胞核溶解以致肝组织局部坏死，含铁血黄素沉着(图1-6)。

饲料添加高浓度芦丁组脾脏黑色素巨噬细胞中心少，红髓严重减少，白髓增多，出现红血细胞减少等现象，细胞开始出现炎症，且出现含铁血黄素沉着等现象(图1-7)。

精巢组织疏松，芦丁添加组精巢发育状态基本一致，但高浓度会抑制精母细胞的发育，且出现凋亡细胞(图1-8)；低浓度芦丁能造成卵巢凋亡细胞增多，高浓度芦丁添加组能抑制卵母细胞的发育(图1-9)。

图1 饲料添加芦丁对吉富罗非鱼幼鱼组织学的影响Fig.1 Effects of rutin feed addition on histological slices of juvenile GIFT tilapia (O.niloticus)1.对照组肠道, 2.芦丁0.1 g/kg添加组肠道, 箭头显示血小板, 3.芦丁0.3 g/kg添加组肠道, 箭头显示血小板; 4.对照组肝脏, 5.芦丁0.1 g/kg添加组肝脏, 箭头显示凋亡细胞, 6.芦丁0.3 g/kg添加组肝脏, 箭头显示凋亡细胞; 7.芦丁0.3 g/kg添加组脾脏, 黑色箭头显示炎症, 箭头显示含铁血黄素沉着; 8.芦丁0.3 g/kg添加组精巢, 箭头显示凋亡细胞; 9.芦丁0.3 g/kg添加组卵巢, 箭头显示卵母细胞受到抑制. 注:血小板(bp);杯状细胞(gc); 嗜酸性粒细胞(egc); 红血细胞(rbc); 空泡(va); kupffer细胞(kc); 炎症细胞(ic); 次级 精母细胞(ss); 精子细胞(sd); 卵黄颗粒(yg); 滤泡层(fl).

2.2 细胞凋亡观察结果

相比对照组肠道组织，饲料添加低浓度芦丁组肠道组织出现了大量的凋亡细胞(棕色，图版2-1)且AI显著高于对照组(表2)；饲料添加不同浓度芦丁组肝脏组织出现了凋亡细胞(图版2-2)且AI显著高于对照组；仅饲料添加高浓度芦丁组脾脏组织出现了凋亡细胞(图版2-3)，且AI显著高于对照组。

表1 饲料添加芦丁对吉富罗非鱼幼鱼组织学的影响Tab.1 Effects of rutin feed addition on histological slices of juvenile O.niloticus

表2 饲料添加芦丁对吉富罗非鱼幼鱼细胞凋亡阳性率的影响Tab.2 Effects of rutin feed addition on positive ratio of apoptosis in juvenile O.niloticus

图2 饲料添加芦丁对吉富罗非鱼幼鱼细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of rutin feed addition on apoptosis in juvenile O.niloticus注：1.芦丁0.1 g/kg添加组肠道, 2.芦丁0.3 g/kg添加组肝脏, 3.芦丁0.3 g/kg添加组脾脏, 箭头显示凋亡细胞

3 讨论

3.1 高浓度芦丁能造成吉富罗非鱼器官损伤

Kupffer细胞位于肝血窦内表面，是一类发挥重要作用的吞噬细胞[16]。该研究中高、低浓度芦丁添加组造成肝脏受损，这与饲料添加高浓度多酚类造成鼠肝损伤的研究结果保持一致[17]，且可能是通过刺激肿瘤坏死因子生成并通过NF-κB通路造成损伤[16]；Kupffer细胞减少，高浓度组肝脏出现细胞凋亡，这些结果与21-氨基类固醇激活NF-κB通路导致凋亡相一致。有研究表明芦丁造成肝损伤可能原因是其在肝脏蓄积，引起免疫系统紊乱[18-19]。总之，该研究表明高浓度芦丁可能通过抑制免疫细胞产生，激活凋亡相关信号通路引起吉富罗非鱼肝脏组织损害。

含铁血黄素是由铁蛋白微粒集结而成的色素颗粒[20]，该研究中高浓度芦丁添加组含铁血黄素(hemosiderin)沉着，这与乙二醇单丁醚(低毒，常用于油漆等行业)造成鼠肝脏含铁血黄素沉着相一致[21]。研究表明鱼腥草粗提物(含黄酮类和挥发油成分)能增强脾脏淋巴细胞，且能影响脾脏免疫基因的表达[22-24]。该研究中芦丁能造成肠道、肝脏和脾脏细胞(高浓度组)凋亡，这与香泽兰总黄酮造成斑马鱼(Daniorerio)脾脏坏死结果相一致[25]。脾脏含白髓和红髓(动物体内最大的淋巴器官)，经刺激可产生淋巴细胞和巨噬细胞，巨噬细胞分解血红蛋白后生成少量的含铁血黄素沉淀[26]，该研究中高浓度芦丁造成吉富罗非鱼红髓严重减少，红血细胞分散并减少，这与染料木黄酮造成鼠脾脏损伤结果相一致[27]，说明高浓度芦丁已造成吉富罗非鱼脾脏损伤。

有研究表明芦丁能跨过小肠上皮细胞进入到机体内，在小肠液中可稳定保持至少2-4 h，不断摄入能使得芦丁在血液中积累，肠道黏膜上皮细胞内的酶能将芦丁降解为苯甲酸衍生物而被吸收[9]，该研究中少量的芦丁能使肠道组织更为紧凑，这可能与芦丁能发挥肠道黏膜修复功能及血管舒张功能相关[9]。日粮添加大豆异黄酮会对环江香猪(fragrance pig，Sus scrofa)的生殖器官发育产生影响，且与大豆异黄酮剂量有关[28]。植物中的有效物质，如甘草酸能通过激素生物合成和代谢通路来降低血液激素水平[29]。该研究中饲料添加不同浓度芦丁还能对生殖器官的发育起到抑制作用，具体机制还需要进一步研究。

3.2 水产领域中草药(鱼腥草)主效成分的应用推广

有研究表明，芦丁能增强哺乳动物免疫能力[4-8]，能促进胸腺、脾脏和肝脏的发育[1-3]。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物(flavonoids)，黄酮类化合物在水产动物抗菌防病方面起着重要的作用，如大豆异黄酮能增强卵形鲳(Trachinotusovatus)的非特异性免疫能力和抗氧化能力[30-31], 从雪松(Cedrusdeodara)中提取的双氢槲皮素能增强金头鲷(SparusaurataL.)的免疫能力，且低浓度适合作为添加剂使用。芦丁属黄酮类化合物，在鱼腥草根部的含量高达0.3%[32]，在水产上的研究表明其能增强凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)抗溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的能力[33]。前期其他课题组和笔者已经将鱼腥草用于吉富罗非鱼养殖池塘的水质净化，鱼腥草中含有的黄酮类物质和挥发油对革兰氏阳性菌(如链球菌)有较好的抑菌作用[34]，罗非鱼采食鱼腥草根部若能进一步提高其抗病和免疫能力将有利于加以推广应用，这将有助于挽回每年链球菌病给罗非鱼产业带来的损失。此外，鱼腥草还能作为中草药或蔬菜使用，也会进一步带动养殖户投入到生产中，增加额外收入。

国内外关于芦丁作为饲料添加剂增强免疫能力的研究主要集中在家养动物和哺乳动物身上[1-5,7-8]，而对于水产动物的研究较为少见[6,33]。若要想通过饲料添加芦丁来达到增强罗非鱼免疫能力的目的，势必不能影响罗非鱼组织器官的发育，特别是幼鱼。本研究结果表明较高浓度的芦丁会造成免疫和生殖器官的损伤。目前有研究通过壳聚糖包裹芦丁缓释达到抑制炎症反应发生的效果[35]，若能在饲料中采用此做法达到抗炎效果且不损伤幼鱼的组织器官发育，芦丁则极有可能作为吉富罗非鱼饲料免疫增强剂加以开发使用。

4 结论

较高浓度的芦丁会造成免疫和生殖器官的损伤，芦丁作为水产行业免疫增强剂需慎用。

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(责任编辑：张红林)

Effects of rutin on histological slices and apoptosis of juvenileOreochromisniloticus

ZHENG Yao1,2, ZHAO Zhi-xiang2, SHI Lei-lei2, SONG Chao1, XU Pao1,2, CHEN Jia-zhang1,2,3

(1.FisheryEco-EvironmentMonitoringCenterofLowerReachesofYangtzeRiver,MinistryofAgriculture/LaboratoryofQuality&SafetyRiskAssessmentforAquaticProductsonEnvironmentalFactors(Wuxi),MinistryofAgriculture/FreshwaterFisheriesResearchCenter,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuxi214081JiangSu,China;2.WuxiFisheryCollege,NanjingAgriculturalUniversity,Wuxi214081;3.KeyLaboratoryofQualityandSafetyControlforAquaticProducts,MinistryofAgriculture,Beijing100141,China)

The purpose of this study was to find the effects on rutin (as immunity enhancer) feed addition for juvenile GIFT tilapia (Oreochromisniloticus), which was determined by histological sections of immune and reproductive organs and Tunel analysis in rapid growth duration under different concentration of rutin addition (0, 0.1 and 0.3 g/kg).Results showed that much higher ratio of the blood platelet in the intestinal tissue has been revealed, and goblet cells demonstrated irregular in lower concentration of rutin group compared with the controls.The liver structure demonstrated existing less Kupffer cells, but caused higher positive ratio of apoptosis cell both in intestine and liver.While in the higher concentration rutin groups, the emergence of apoptosis, hemosiderin pigmentation and higher positive ratio of apoptosis cell has been found in the spleen and liver tissues, and it also caused fewer melanin macrophages center in spleen.In addition, it also revealed the inhibitory development effects for testis and ovary tissues in high concentration rutin groups.To conclude, it is with caution to use rutin as immunity enhancer in aquaculture industry.

rutin; GIFT tilapia(Oreochromisniloticus); histological sections; apoptosis

2016-11-16；

2017-03-02

现代农业产业技术体系专项(CARS-49); 中央级科研院所基本科研业务费(2015JBFR03); 公益性行业(农业)科研专项(201503108); 国家农产品质量安全风险评估项目

郑 尧(1986- )，男，博士，助理研究员，主要从事水产品质量安全与分子毒理学研究。E-mail: zhengy@ffrc.cn

陈家长，E-mail: chenjz@ffrc.cn；徐跑，E-mail:xup@ffrc.cn

S963.73

A

1000-6907-(2017)03-0073-06