黄鳝PLA2基因的克隆及表达分析

张燕萍，钟 杰，周秋白，郭 枫，张 俊，钟潮明，王自蕊

(1.江西农业大学动物科学技术学院，南昌 330045；2.江西省水产科学研究所，南昌 330039)

黄鳝PLA2基因的克隆及表达分析

张燕萍1，2，钟 杰1，周秋白1，郭 枫1，张 俊1，钟潮明1，王自蕊1

(1.江西农业大学动物科学技术学院，南昌 330045；2.江西省水产科学研究所，南昌 330039)

利用同源克隆技术和RACE技术克隆黄鳝(Monopterusalbus)磷脂酶A2(PLA2)基因的cDNA全长；并采用荧光定量RT-PCR法检测PLA2基因在黄鳝各组织中的表达量情况。结果显示：黄鳝PLA2基因全长cDNA大小为2 606 bp(GenBank登录号：KX852397)，其中开放阅读框2 205 bp，编码736个氨基酸，预测分子大小为83.623 kD，理论等电点5.84；5′和3′非编码区长度分别为208 bp和193 bp。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构。氨基酸序列比对和系统树分析显示，黄鳝PLA2基因的结构十分保守，黄鳝与大黄鱼和金头鲷的PLA2基因亲缘关系最近，与鼠类和蟾蜍的亲缘关系较远。RT-PCR分析表明，PLA2基因在组织中的表达具有组织特异性，在消化器官前肠组织中的表达最高，在性腺及肌肉组织中表达很少。

磷脂酶A2；黄鳝(Monopterusalbus)；克隆；组织表达

磷脂作为细胞膜的重要组成成分[1]，对维持细胞膜功能发挥重要作用。大量研究表明，磷脂在鱼虾胚胎发育、幼体早期发育阶段、以及维持鱼虾类正常的生理活动中发挥重要的功能作用[2-3]。在仔稚鱼微颗粒饲料中添加磷脂，尤其是磷脂酰胆碱(PC)，可显著增强仔稚鱼的摄食活动，提高脂蛋白合成、脂肪吸收和转运以及抗应激能力，促进仔稚鱼生长等[4-6]。目前，研究者对蛋白酶和淀粉酶在仔稚鱼蛋白质和碳水化合物消化代谢过程的作用机制等进行了大量研究。然而，有关幼鱼饲料中磷脂消化酶的报道却很少[7-10]。

磷脂酶A2(Phosphlipase A2, PLA2)是一种重要的代谢和调节酶类，是水解天然磷脂的催化酶，广泛存在于哺乳动物胰腺、蜂毒和蛇毒中。根据磷脂酶对磷脂水解部位的不同可将磷脂酶分为A1、A2、C和D 4种类型[11]。由于PLA2能特意性水解磷脂sn-2位的脂肪酸，产生溶血磷脂和游离脂肪酸，溶血磷脂和游离的脂肪酸分别在高等动物膜磷脂更新[12]、炎症反应[13]以及抗菌[14]过程中发挥重要作用，使得PLA2的研究越来越受到关注。PLA2在水产饲料中得到广泛应用，在鱼类饲料中添加PLA2可以帮助分解饲料中的磷脂物质，以便于动物的吸收利用；给仔稚鱼饲喂含PLA2的饲料，可明显提高仔稚鱼的脂肪消化能力；将磷脂酶直接饲喂动物或将含磷脂酶的饲料喂养，可以改善饲料利用效率和促进动物生长[15]。迄今为止，已从多种鱼类中克隆到PLA2基因的cDNA全长或部分序列，并对其在仔稚鱼生长发育过程的表达情况进行了研究。如大黄鱼(登录号：KKF13860.1)、金头鲷(登录号: AGV13281.1)、尼罗罗非鱼(登录号: XP_003445168.2)、青鳉(登录号: BAQ59082.1)、斑马鱼(登录号: AAA53229.1)等。然而，目前有关黄鳝PLA2基因的研究却还未见报道。因此，本研究以我国重要经济鱼类黄鳝(MonopterusalbusZuiew)为研究对象，采用RACE技术克隆鉴定黄鳝PLA2基因的cDNA全长序列，进行序列比对分析，并采用实时荧光定量技术分析PLA2基因在黄鳝各组织器官中的表达情况，以期为进一步研究PLA2生物学功能及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用黄鳝及受精卵和仔鱼取自于江西农业大学黄鳝繁殖基地。RNA提取试剂Trizol购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T载体、RT-PCR试剂盒、Taq酶、dNTP、3′/5′-RACE试剂盒等购自大连宝生生物公司；Power SYBR Green PCR Master Mix购自赛默飞世尔科技公司。

1.2 取样方法

基因克隆取样使用人工饲养体质量约50 g的黄鳝肝脏。尾静脉放血剖开腹部暴露，剪取肝组织约50～100 mg，立即装入经DEPC处理、高温高压灭菌后的1.5 mL离心管内，投入液氮速冻，-70 ℃冰箱保存备用。基因表达使用的黄鳝组织为脑(N)、肝脏(G)、脾脏(P)、前肠(Q)、中肠(Z)、后肠(H)、肾脏(S)、性腺(S)和肌肉(J)。每个组织6个重复，取样后立即提取RNA用于基因表达分析。

1.3 引物设计与合成

根据NCBI Genbank数据库中其他脊椎动物PLA2基因的cDNA序列的保守序列设计克隆黄鳝PLA2基因保守部分的简并引物，扩增中间片段序列，进而根据测定后的序列设计用于RACE扩增、荧光定量PCR等的引物(表1)。引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 黄鳝PLA2基因克隆与定量分析所用引物Tab.1 Primers used to amplify and express the rice field eel PLA2 gene

1.4 总RNA 提取

总RNA的提取根据Trizol reagent试剂盒说明书操作。总RNA的浓度和纯度用紫外分光光度计进行检测，并用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测和A260/A280比率确定RNA的完整性。

1.5 黄鳝PLA2全长扩增与序列分析

用黄鳝肝脏的总RNA作为模板，根据Smart-RCAE试剂盒说明书逆转录合成PLA2基因5′端和3′端的第一链cDNA。克隆获得部分序列后进行3′-RACE和5′-RACE扩增将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取阳性克隆的菌液送上海生物工程有限公司进行测序。将测序结果采用DNAMAN5.0软件拼接序列，获得PLA2基因序列的cDNA全长。

1.6 实时荧光定量 PCR

根据黄鳝PLA2基因的开放阅读框(ORF)设计qRT-PCR引物PLA2-QF和PLA2-QR，以18 s(登录号：EU120033.1)为内参(表1)，按照Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific)试剂盒说明书反应体系、用CFX384多重实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)进行荧光定量PCR。循环程序为，95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s，63 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，40个循环。18 s的表达量被作为样品间的参考基因。每样品重复3次，结果计算采用Livak的2-ΔΔCt方法[16]。

1.7 数据分析

利用在线ORF finder tool软件预测黄鳝PLA2基因的ORF和相应的氨基酸序列，用DNASTAR软件对不同物种的PLA2序列进行同源性分析，用SignalP 4.1在线分析PLA2基因的信号肽，并用Mega 4.0的邻位相邻法构建蛋白的系统进化树[17-18]，ExPASy在线软件预测蛋白质功能位点。数据用平均数±标准差表示，并用Origin 8.0作图，统计分析采用SPSS 16.0，在单因素方差分析(One-way ANOVA)基础上采用Duncan’s多重比较法，显著水平取值P<0.05。

2 结果

2.1 黄鳝PLA2基因全长cDNA的克隆

以黄鳝肝脏组织总cDNA为模板，通过简并引物进行巢式PCR，获得370 bp 扩增片段；通过5′和3′ RACE-PCR扩增，分别获得长度为1 876 bp和530 bp的扩增片段(图1)。用软件DNAMAN拼接得到黄鳝PLA2基因全长cDNA序列为2 606 bp(登录号：KX852397)，包含一个2 205 bp的开放阅

读框、5′和3′末端的非编码区分别为208 bp 和193 bp。其ORF编码1个有736个氨基酸组成的多肽，起始密码子为ATG和终止密码子为TAA，3′末端含有1个典型的加尾信号AATAAA和15 bp的Poly(A)尾(图2)。预测分子质量约为83.623 kD，理论等电点5.84。

图1 同源片段、5′RACE、3′RACE电泳图Fig.1 Homologous fragment, 5′RACE, 3′RACE electrophoresis DL5000 Marker：100，250，500，750，1000，1500， 2000，3000，5000

2.2 黄鳝PLA2氨基酸序列分析

序列分析结果表明该蛋白没有信号肽和跨膜结构，包含3个Ca2+结合、1个PLA2活化位点、9个半胱氨酸位点、1个C2结构域和cPLA2_Grp-IVA结构域。黄鳝PLA2基因和已知其它物种的PLA2氨基酸序列比对结果表明(图3)，黄鳝PLA2推导的氨基酸序列与深裂眶锯雀鲷(Stegastespartitus，XP_008293739.1)、大黄鱼(Larimichthyscrocea, KKF13860.1)、金头鲷(Sparusaurata, AGV 13281.1)、青鳉(Oryziaslatipes, BAQ59082.1)和斑马鱼(Daniorerio, NP_571370.1)的PLA2具有较高的同源性，相似性为92%～78%，其中与深裂眶锯雀鲷PLA2蛋白的相似性最高达92%，其次是大黄鱼91%。

2.3 黄鳝PLA2系统进化树

利用MEGA4.0软件对黄鳝和其他物种的PLA2氨基酸序列按邻接法构建系统发育树(图4)，结果显示：鱼类的PLA2基因聚类为独立的分支，其中黄鳝的PLA2基因与大黄鱼、金头鲷的亲缘关系最近，与鼠和爪蟾的亲缘关系较远。

图2 黄鳝PLA2基因cDNA序列及所推导的氨基酸序列Fig.2 cDNA and deduced amino acid sequences of PLA2 of M.albus 起始密码子ATG、终止密码子TAA、多聚腺苷酸信号AATAAA都以下划线 显示，3个跨膜蛋白结构域用框标注。

图3 不同鱼类PLA2的氨基酸序列比对分析Fig.3 Alignment of the known PLA2′ s amino acid sequences from fish specis RxRH 和GxSGS序列用双下划线标注

图4 基于黄鳝和其他物种PLA2氨基酸序列的 NJ系统进化树Fig.4 Construction of Neighbor-joining phylogenetic tree based on PLA2 amino acids of M.albus and othe species深裂眶锯雀鲷:XP_008293739.1;大黄鱼:KKF13860.1;金头鲷:AGV13281.1;青鳉:BAQ59082.1;底鳉:JAR83022.1;斑马鱼:NP_571370.1;尼罗罗非鱼:XP_003445168.2;非 洲爪蟾:NP_001080867.1;褐家鼠:NP_598235.2.黄鳝 PLA2基因用黑框标定

2.4 PLA2基因在黄鳝各组织的表达

使用qRT-PCR技术检测PLA2基因在黄鳝脑、肝脏、前肠、中肠、后肠、性腺、脾脏、肾脏以及肌肉等成体组织中的表达情况，结果(图5)显示，PLA2基因在黄鳝被检测的成体组织中均表达，但在消化系统的前肠组织中高丰度表达，其表达量显著高于中肠组织(P<0.05)，极显著高于其他组织(P<0.01)，在性腺及肌肉组织中表达量很少。后肠表达量明显低于前肠和中肠(P<0.001)。

图5 RT-PCR 检测黄鳝 PLA2 的组织特异性表达 Fig.5 Tissue specific expression of PLA2 mRNA in M.albus用单因素方差分析数据,每个柱子上面的不同字母表示显著差异(P<0.05).组织:脑(N),肝脏(G),脾脏(P),前肠(Q),中肠(Z),后肠(H),肾脏(S),性腺(X),肌肉(J)

3 讨论

PLA2是一系列参与磷脂代谢的酶，按照是否依赖钙离子分为依赖钙离子的分泌型sPLA2(相对分子质量14×103)、胞浆型cPLA2(相对分子质量85×103)及非钙依赖型iPLA2[14]。本研究采用同源克隆和RACE技术克隆到黄鳝PLA2基因的全长cDNA 序列，其分子质量为83.623 kD，理论等电点5.84，通过分子大小可以确定本研究克隆到的PLA2属于胞浆型的。氨基酸序列分析表明它具有3个Ca2+结合位点、1个PLA2活化位点和9个半胱氨酸残基，具有明显的PLA2结构特征。与已报道的脊椎动物PLA2氨基酸序列比对，发现克隆到的黄鳝PLA2基因与其他鱼类cPLA2基因相似度较高(78%～92%)。系统进化树分析表明，黄鳝PLA2基因与其他鱼类亲缘关系较近，与蟾蜍和鼠类亲缘关系较远，符合生物进化规律。本研究还发现，黄鳝PLA2基因与其他物种一样，其蛋白质含有脂质结合的Ca2+依赖的C2结构域和起催化作用的cPLA2_Grp-IVA结构域[19-20]，C2 结构域与内膜结合是由神经酰胺-1-磷酸的作用决定的，哺乳动物的C2 结构域包含一段可以调节神经酰胺-1-磷酸特异性的精氨酸、精氨酸和组氨酸高度保守序列(RxRH)[21]。将多种鱼类的cPLA2基因进行比对，发现只有斑马鱼的cPLA2基因存在RxRH，青鳉、金头鲷、大黄鱼、尼罗罗非鱼等鱼类的保守序列为精氨酸、苏氨酸、赖氨酸和组氨酸(RTKH)[22]，而黄鳝的却是精氨酸、苏氨酸、谷氨酸和组氨酸(RTEH)。黄鳝PLA2基因的C2结构域与其他物种存在差异，这表明黄鳝PLA2与膜结合的调节机制可能与其他鱼类及哺乳动物不太相同。另外，脂肪酸的保守序列甘氨酸、丝氨酸、甘氨酸和丝氨酸(GxSGS)是区别cPLA2与其他类型PLA2的标志[23]，该保守序列存在于黄鳝和其他鱼类的PLA2基因中，且与其他物种高度保守。

多数研究者认为鱼类磷脂分解代谢机制与哺乳动物是一致的，均是在肠道内由胰腺分泌的PLA2水解产生溶血磷脂和游离的脂肪酸，再被肠细胞吸收[24]。Fujikawa等[25]对发现的PLA2的新亚型 PLA2-IB基因在真鲷成体消化器官中的组织分布做了详细研究，表明DE-1 PLA2在消化器官胰腺中表达，DE-2 PLA2不仅在胰腺、胃、幽门盲囊上皮细胞、肠上皮细胞等消化器官中表达，还在非消化器官如心脏、肌纤维以及卵母细胞中表达。Renaud等[26]在哺乳动物、爬行动物、节肢动物的胰腺、胃、肠、脾、心、肝、脑等组织中分离提纯到cPLA2，这些研究表明，cPLA2广泛存在动物各种组织中。本研究发现PLA2基因在黄鳝成体组织中具有器官表达特异性，其在所有检测组织中均表达，但各组织的表达水平存在差异，该基因主要在成体黄鳝的消化系统肠道组织中表达，在黄鳝前肠组织中表达量最高，其次是中肠，而在性腺和肌肉组织中表达量最低。这表明黄鳝PLA2基因在组织中的表达方式与磷脂消化代谢途径相一致，磷脂是在肠道中分解代谢的，黄鳝PLA2在前肠、中肠、后肠的表达水平逐渐降低，这表明磷脂主要在黄鳝的前肠中分解代谢，后肠主要是吸收磷脂的水解产物，其表达水平相对较低。在黄鳝脑、肝脏和脾脏组织中较高表达，可能与与其活跃的代谢功能相关，即与特定组织的重要代谢途径有关，其具体原因还有待于进一步研究。

本研究探明了黄鳝PLA2基因的结构及组织表达模式，丰富了鱼类PLA2的生物学基础，为进一步深入研究鱼类PLA2生物学功能和作用机制奠定了基础。

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(责任编辑：张潇峮)

Cloning and expression analysis of PLA2 fromMonopterusalbus

ZHANG Yan-ping1,2, ZHONG Jie1, ZHOU Qiu-bai1, GUO Feng1, ZHANG Jun1, ZHONG Chao-ming1, WANG Zi-rui1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China;2.JiangxiFisheriesResearchInstitute,Nanchang330039，China)

In the present study, the rapid-amplification of cDNA ends (RACE) was used to the cDNA sequences of cytosolic phospholipase A2 (PLA2) ofMonopterusalbus, and the tissue expression analysis was used by RT-PCR in different tissues.The results indicated that the full length cDNA sequence ofM.albusPLA2 consist of 2 606 bp, containing an open reading frame (ORF) of 205 bp.It contains a 208 bp 5′ untranslated region (UTR) and a 193 bp 3′ terminal UTR.The putative PLA2 is predicted to be a peptide of 735 amino acids, with a calculated molecular weight of 83.623 kD and an isoelectric point of 5.84.The PLA2 has not predicted signal peptide and transmembrane helices.Amino acid alignment and phylogenetic analyses results showed that the PLA2 amino acid sequence ofM.albuswas relatively conserved in fish, PLA2 of rice field eel was more closely related to that ofLarimichthyscroceaandSparusaurata, but had a distant relationship with rats and toad.The RT-PCR analysis showed that the PLA2 presented the tissue specificity to varying degrees.PLA2 mRNA is constitutively expressed in all the examined organs of healthy rice field eel, with the highest level in foregut of intestinal digestive organs, and with the lower level in gland and muscle.

cytosolic phospholipase A2 (PLA2);Monopterusalbus; cloning; tissue expression

2016-09-17；

2016-11-30

国家自然科学基金(31360641)

张燕萍(1979-)，女，博士，助理研究员，主要从事水生动物遗传育种和渔业资源调查。E-mail: zhangyanpingxie@163.com。钟杰与第一作者同等贡献。

周秋白。E-mail: zhouqiubai@163.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)03-0016-09