基于线粒体16SrRNA基因序列的长江下游重要水体脆弱象鼻溞群体遗传结构分析

崔光艳，付立霞，王柳富，魏文志

(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009)

基于线粒体16SrRNA基因序列的长江下游重要水体脆弱象鼻溞群体遗传结构分析

崔光艳，付立霞，王柳富，魏文志

(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009)

为了解长江下游地区10个水体脆弱象鼻溞群体的遗传结构，研究测定了脆弱象鼻溞(Bosminafatalis)线粒体16SrRNA基因序列，结果显示，100个样本中共有8个变异位点，定义了9个单倍型，单倍型多样性(Hd=0.284)和核苷酸多样性(Nd=0.000 76)均较低。AMOVA分子变异分析结果表明，脆弱象鼻溞遗传分化主要来自群体内，占93.33%，群体间的变异低，占6.67%。Fst值统计检验表明，各水体之间遗传分化不显著。系统发育树和中介网络图说明脆弱象鼻溞单倍型间关系较近，未形成明显谱系地理格局。中性检验和错配分布结果说明脆弱象鼻溞出现过群体扩张现象。

脆弱象鼻溞(Bosminafatalis)；长江下游；16SrRNA；群体遗传结构

象鼻溞(Bosmina)分类上属于节肢动物门，甲壳动物亚门、甲壳动物纲、双甲目、象鼻溞科，主要分布在湖泊、河口敞水区、水库中，是淡水生态系统中浮游甲壳动物优势种[1]。

我国一般把象鼻溞分为3类，即长额象鼻溞(B.longirostris)、脆弱象鼻溞(B.fatalis)、简弧象鼻溞(B.coregoni)[2]。范凤娟[3]从尾爪栉刺的列数及COΙ和ITS标记基因得出我国西部地区为长额象鼻溞，海南和东部地区为脆弱象鼻溞。象鼻溞会根据捕食者或者其他环境因素的压力诱导改变自身的形态特征，进而有利于在环境中生存[4-5]，不同水体环境中的象鼻溞表型差异较大，关于象鼻溞的分类还存在较大争议。目前国内外关于象鼻溞研究主要集中在形态、生态环境、群落结构等方面[6-7]。线粒体DNA(mtDNA)具有进化速度快、母系遗传及易扩增等优点，已成为分子进化研究中的理想材料[8]，其中16SrRNA既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，已成为广泛应用于水生动物群体遗传多样性和系统进化分析研究的分子标记[9]。本实验以线粒体16SrRNA基因为分子标记，采用DNA测序技术对长江下游地区多个重要水体脆弱象鼻溞地理群体的16SrRNA基因序列进行测定，探讨长江下游地区脆弱象鼻溞的群体遗传结构，为揭示不同群体的系统发育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2014年5月初对长江下游地区的10个湖泊和水库进行了样本的采集(图1)。分别是骆马湖(LMH)，洪泽湖(HZH)，宝应湖(BYH)，高邮湖(GYH)，邵伯湖(SBH)，滆湖(GH)，太湖(TH)，巢湖(CH)，河王坝水库(HWB)和枣林水库(ZL)。采样时用13号浮游生物网采集水中的浮游动物，将浮游动物转移到采样瓶中，无水乙醇固定。

图1 采样地点图Fig.1 A map of the sampling locations

1.2 DNA的提取，扩增及序列测定

显微镜下挑选单个脆弱象鼻溞，蛋白酶K法消化，提取基因组DNA，具体方法为单个脆弱象鼻溞加入60 μL的蛋白酶K缓冲液(10 mmol/L Tris/HCl(pH 8.0)，50 mmol/L KCl，0.005%(v/v)NP-40，0.005%(v/v)Tween 20，加入蛋白酶K使其终浓度为0.1 mg/mL)，然后55 ℃在水浴锅中过夜，取出后置于95 ℃水浴锅中将蛋白酶K灭活15 min，保存于-20 ℃。16SrRNA引物[10]为16Sar-L (5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC ATC-3′)，16Sbr-H(5′- CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′)。PCR反应的总体积为30 μL，反应体系包括：Extaq(Takara) 15 μL，引物各1.5 μL，DNA模板3 μL。PCR扩增反应程序为：94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40个循环。PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。最终成功测序的样本数为LMH 5个，HZH 11个，BYH 10个，GYH 10个，SBH 11个，GH 12个，TH 10个，CH 13个，HWB 6个，ZL 12个。

1.3 DNA序列数据分析

采用软件Clustal X对序列进行校正比对，用Dna SP v5计算所得序列的碱基组成、保守位点、变异位点、简约信息位点、单一突变位点。计算单倍型数目(h)，单倍型多样性(Hd)，核苷酸多样性(Nd)，绘制群体错配分布图。用Arlequin3.5.1.2软件中的分子变异分析方法(AMOVA)计算群体间、群体内的遗传分化Fst值，利用Tajima′sD，Fu′sFs中性检验和错配分布来推断是否发生过群体扩张。采用MEGA 5.0对序列进行系统发育分析，根据Kimura 2- Parameter选用邻接法(NJ)构建象鼻溞分子系统进化树，进化树分支的置信度采用自展法(Bootstrap) 重复检测1 000次。采用Network 4.6程序构建群体内所有单倍型的中介网络图。

2 结果与分析

2.1 碱基组成及序列变异

本研究共获得100条序列，有3个碱基的缺失和插入，其中保守位点456个，变异位点8个(表1)，变异百分率为1.71%。突变总数为8个，其中简约信息位点3个，单一变异位点5个，所测序列中16SrRNA基因碱基组成为：A 35.2%，T 33.8%，C 11.6%和G 19.4%，A+T 含量为69.0%，G+C 含量为31.0%，表现出明显的碱基A/T偏倚性，符合无脊椎动物线粒体基因序列碱基组成特点[11]。

2.2 群体遗传结构

100条16SrRNA基因序列检测出9种单倍型，分别命名H1-H9。对各群体序列进行多样性分析表明，单倍型H2出现频率最高为85.0% (85/100)，且被10个地理群体所分享，其次是单倍型H3出现的频率最高，为4.0% (4/100)，为2个地理群体所共有，其他单倍型为私有单倍型(表1)。

根据DnaSP5.0软件分析结果表明，总群体单倍型多样性为0.284，核苷酸多样性为0.000 76。不同地理群体的单倍型多样性在0.000～0.500之间，核苷酸多样性在0.000 00～0.001 92之间，其中骆马湖单倍型多样性最高(Hd = 0.500±0.265)，邵伯湖核苷酸多样性最高(Nd = 0.001 92 ± 0.000 95)。

表1 不同地理群体脆弱象鼻溞16SrRNA基因遗传多样性Tab.1 Genetic diversity of 16SrRNA among different geographic populations of B.fatalis

2.3 遗传分化分析

应用Arlequin3.5.1.2软件进行AMOVA分子变异分析表明(表2)，10个地理群体间遗传分化变异较小(Fst=0.066 7，P=0.02)。群体间方差组分为0.014 5，占方差比率的6.67%，而群体内部的方差组分为0.203 2，占方差比率的93.33%，群体内的遗传变异大于群体间的遗传变异，说明象鼻溞的群体遗传分化主要来自群体内，而不是群体间。通过计算两两群体间Fst值得到的结果显示，各水体之间差异不显著(表3)。

表2 脆弱象鼻溞10个群体16SrRNA基因的分子变异分析Tab.2 Analysis of molecular variance (AMOVA) of 16SrRNA gene in 10 geographic populations of B.fatalis

表3 脆弱象鼻溞不同群体间的遗传分化系数Fst值Tab.3 Fst between pairwise populations of B.fatalis

注：下三角为Fst值，上三角为P值

2.4 系统发育分析

选取颈沟基合溞(Bosminopsisdeitersi)16SrRNA基因序列(GenBank登录号：AF484022.1)作为外群，再选取Genebank中已报道的象鼻溞21个参考序列与本实验的9个象鼻溞16SrRNA基因单倍型进行构建。结果显示，本研究获得的9个单倍型处于平行地位，都与脆弱象鼻溞聚在一起，并且本研究全部单倍型与其他象鼻溞序列分开，说明本研究的象鼻溞为脆弱象鼻溞。H2为各个水体的共享单倍型，聚类树内各节点支持率较低，说明各单倍型之间关系较近。总体看来，系统发育树并未反映出与地理位置相关的信息，未形成明显的系统地理结构(图2)。

单倍型网络图能进一步说明各单倍型之间的关系，利用Network 4.6程序构建单倍型网络图(图3)，根据结果可知，单倍型的分布与系统发育树结果吻合(图2)。各群体的私有单倍型与共享单倍型关系密切，大多数单倍型以H2为中心呈“星状”分布，表明H2在地理范围上分布最广泛，各地理群体间不存在明显的分化关系。

2.5 群体历史分析

Tajima′sD和Fu′sFs中性检测可以用来推测群体在发展过程中是否经历过群体扩张。对10个群体进行中性检验，检测结果均不显著(P>0.10)，将所有个体作为一个整体进行分析，总群体Tajima′sD值为-1.975 35(P<0.10)，Fu′sFs值为-8.067 87(P<0.10)，均为负值，并且统计检验均达显著水平，错配分布图呈现单峰分布，说明脆弱象鼻溞群体经历过群体扩张(图4)。

图2 基于16SrRNA基因的NJ系统树Fig.2 Phylogenetic tree of 16SrRNA gene sequences using NJ algorithm 分支上的数字为Bootstrap值

图3 16SrRNA基因单倍型的中介网络图Fig.3 Median-joining haplotype network ofB.fatalis based on 16SrRNA gene 圆面积代表单倍型出现频率，扇形面积代表 各样品群体在同一单倍型中所占的比例。

图4 脆弱象鼻溞不同群体的错配分布图Fig.4 Mismatch distributions of B.fatalis

3 讨论

遗传多样性是生物多样性形成的基础，一般而言，物种遗传多样性的高低与其适应环境的能力以及进化潜力密切相关。单倍型多样性和核苷酸多样性是衡量群体遗传多样性的两个重要指标。本实验中，脆弱象鼻溞单倍型多样性为0.284±0.067，核苷酸多样性为0.000 76±0.000 20，表现出较低的遗传多样性[12]。象鼻溞以孤雌生殖为主[13]，不同个体之间基因交流较困难；河王坝水库、枣林水库等为新中国成立后拦坝蓄水而形成，仅具有较短的扩张历史，尚未积累较多的遗传变异；各样点湖泊位于长江下游，气候条件和水体环境因子差异不大，对脆弱象鼻溞构成的选择压力不大，因此脆弱象鼻溞群体间的遗传分化较小。

生物地理群体之间基因流的阻隔和环境因子之间的差异可导致不同群体之间遗传结构的显著差异，遗传分化系数(Fst)是表观群体间遗传分化程度的重要参数[14]，本研究中，AMOVA分析结果显示，脆弱象鼻溞群体内遗传变异占93.33%，群体间遗传变异占6.67%，说明脆弱象鼻溞的遗传分化不是地理隔离形成，而是群体内部个体间的变异造成的。Fst值越大，群体间分化程度越高，Fst=0～0.05时为无分化，0.05～0.15为分化较小，0.15～0.25为中等分化，Fst>0.25，群体间分化明显[15]。10个地理群体间脆弱象鼻溞Fst为0.066 7，说明遗传分化较小，两两群体间Fst值结果显示，脆弱象鼻溞群体间不存在显著的遗传分化。系统发育分析和单倍型网络图均表明各群体间的遗传差异不显著，没有形成明显的系统地理结构。一般认为，水体中浮游动物通过水流、鸟、船等传播交流频繁[16-17]，象鼻溞也有同样的特点。同时，本研究中脆弱象鼻溞分布的10个水体都是独立的水体，但均通过长江及其支流相通，不同水体间，特别是河湖相通的水体间脆弱象鼻溞的基因可以相互交流，使不同群体基因交流的机会增加，没有形成明显的群体遗传结构。

总群体Tajima′sD和Fu′sFs中性检测呈显著负值，错配分布图呈现单峰型，说明脆弱象鼻溞群体在历史进化过程中经历过群体扩张。单倍型网络图呈星状分布特征，分布格局也表明脆弱象鼻溞群体经历过群体扩张现象。

通过对脆弱象鼻溞群体遗传结构的分析，可以了解脆弱象鼻溞各分布地区的群体间关系和遗传机制，今后可以采用更多的分子标记，扩大采样范围，以全面了解脆弱象鼻溞物种多样性及分子地理学关系。

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(责任编辑：张潇峮)

Genetic structure ofBosminafatalisbased on Mito 16SrRNA gene sequences in the water bodies along the lower reaches of the Yangtze River

CUI Guang-yan, FU Li-xia, WANG Liu-fu, WEI Wen-zhi

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,Jiangsu,China)

This study aims to investigate the genetic structure ofB.fatalisfrom 10 water bodies from the lower reaches of the Yangtze River.By using mitochondrial 16SrRNA, 100 individuals were sequenced and analyzed.The results showed that 8 variable sites were detected, and 9 haplotypes were defined based on the 16SrRNA sequences.It indicated a lower haplotype diversity (Hd=0.284)and nucleotide diversity (Nd=0.000 76) in these populations.Molecular variance analysis (AMOVA) demonstrated that most variation was explained by “within populations” (93.33%), and there is no significant variation among populations (6.67%).TheFstrevealed no significant difference among all water bodies.Haplotypes dispersed in different populations showed no obvious geographical structure in the phylogenetic tree and haplotype network.Neutrality and mismatch distribution test indicated that there was recent population expansion ofB.fatalisin spatial scales.

Bosminafatalis; the lower reaches of the Yangtze River; 16SrRNA; genetic structure

2016-12-23；

2017-03-06

国家自然科学基金项目(31200284)；江苏省水产三新工程项目(Y2014-28)

崔光艳(1990-)，女，硕士研究生，专业方向为水产动物营养与生态。E-mail：cgy3247@163.com

魏文志。E-mail: wzwei@yzu.edu.cn

Q145

A

1000-6907-(2017)03-0003-06