丝胶蛋白对链脲佐菌素诱导胰岛细胞株INS-1凋亡相关因子的影响研究

王小杰，刘美晓，谢云鹏，毛晓霞，孙一婵，陈志宏

·论著·

丝胶蛋白对链脲佐菌素诱导胰岛细胞株INS-1凋亡相关因子的影响研究

王小杰1，刘美晓1，谢云鹏2，毛晓霞3，孙一婵1，陈志宏4*

目的 探讨丝胶蛋白对链脲佐菌素(STZ)诱导胰岛细胞株INS-1凋亡相关因子B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的影响。方法 2015年6月—2016年3月，将大鼠胰岛细胞株INS-1分为3组：正常组胰岛细胞株INS-1不作任何处理，STZ组以STZ作用胰岛细胞株INS-1，丝胶蛋白组以STZ和丝胶蛋白作用胰岛细胞株INS-1。CCK-8法检测各组细胞存活率；流式细胞术检测各组细胞凋亡率；实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法和Western blotting法检测凋亡相关因子Bcl-2和Bax mRNA表达及其蛋白的表达。结果 STZ组胰岛细胞株INS-1细胞存活率较正常组降低，丝胶蛋白组胰岛细胞株INS-1细胞存活率较STZ组升高(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示， STZ组胰岛细胞株INS-1细胞凋亡率较正常组升高，丝胶蛋白组胰岛细胞株INS-1细胞凋亡率较STZ组降低(P<0.05)。STZ组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2 mRNA及其蛋白表达水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA、Bcl-2/Bax较正常组降低，Bax mRNA及其蛋白表达水平较正常组升高(P<0.05)；丝胶蛋白组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2 mRNA及其蛋白表达水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA、Bcl-2/Bax较STZ组升高，Bax mRNA及其蛋白表达水平较STZ组降低(P<0.05)。结论 丝胶蛋白可抑制STZ诱导的胰岛细胞株INS-1的凋亡，提高Bcl-2/Bax的比值。

丝胶蛋白质类；链脲菌素；凋亡诱导因子；基因,Bcl-2；Bcl-2相关X蛋白质

王小杰，刘美晓，谢云鹏，等.丝胶蛋白对链脲佐菌素诱导胰岛细胞株INS-1凋亡相关因子的影响研究[J].中国全科医学，2017，20(14)：1697-1701.[www.chinagp.net]

WANG X J,LIU M X,XIE Y P,et al.Effect of sericin on apoptosis related factors in streptozotocin-induced INS-1 cells[J].Chinese General Practice，2017，20(14)：1697-1701.

有研究者预测，到2030年，全球糖尿病患者人数将增加至5.25亿，其中90%的患者为2型糖尿病[1]，2型糖尿病严重影响着人类的健康并且已经成为公共卫生系统的沉重负担[2]。有研究表明，2型糖尿病时细胞凋亡是造成胰岛β细胞功能受损的重要原因，胰岛β细胞凋亡可造成胰岛结构的破坏和功能降低，最终引起血糖控制上的恶化[3]。传统西医疗法单一且不良反应大，而中药治疗糖尿病因其不良反应小在近年来备受关注。丝胶蛋白(sericin)是彩色蚕茧中的水溶性蛋白，本课题组前期研究发现，丝胶水提物(主要成分是丝胶蛋白)能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖水平[4]。而丝胶蛋白的降糖作用是否是通过保护胰岛β细胞而实现的呢？为进一步探讨丝胶蛋白降低血糖的作用机制，本研究以链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导胰岛细胞株INS-1损伤，观察丝胶蛋白对胰岛细胞株INS-1凋亡相关因子B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 2015年6月—2016年3月，大鼠胰岛细胞株INS-1购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；STZ购于美国Sigma公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)购于日本DOJINDO公司；细胞凋亡试剂盒、膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)购于美国BD公司；Trizol购于美国Invitrogen公司；反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒购于日本TaKaRa公司；小鼠抗大鼠Bcl-2和Bax单克隆抗体购于美国Abcam公司；二抗〔辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG〕购于美国KPL公司。丝胶蛋白由彩色蚕茧(由承德医学院蚕业研究所提供)中提取，冷冻干燥成粉末备用，使用时用0.9%氯化钠溶液溶解至所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 大鼠胰岛细胞株INS-1在37 ℃、5%CO2条件下，置于含10%胎牛血清、50 μmol/L β-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中培养。分为3组：正常组、STZ组和丝胶蛋白组，其中正常组胰岛细胞株INS-1不作任何处理；STZ组以10 mmol/L STZ作用胰岛细胞株INS-1 24 h；丝胶蛋白组以10 mmol/L STZ和300 μg/ml丝胶蛋白作用胰岛细胞株INS-1 24 h。

本研究背景：

目前，糖尿病已经成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，在全球糖尿病患者中，90%以上属于2型糖尿病。2型糖尿病主要以血糖水平升高、胰岛素抵抗以及胰岛β细胞功能受损等为主要特征。如何降低血糖水平，保护胰岛，促进胰岛β细胞分泌胰岛素是治疗2型糖尿病的关键。当前治疗糖尿病的方法总体上以药物治疗为主。各类药物虽能较好地控制血糖水平，但大多数药物均有不同程度的不良反应，有相当一部分患者早期就出现肝肾功能损害，在短时间内失去正常生活能力。在糖尿病治疗方面，人们期望治疗糖尿病的药物有以下特点：安全无不良反应，服用方便，疗效显著。因此，近年来国内外研究者将目光转向了具有降糖作用的天然物质。丝胶蛋白是从蚕茧中提取的天然蛋白质，为高分子水溶性蛋白，由18种氨基酸组成，具有生物相容性，可生物降解，对人体无毒性，可避免化学合成药物带给人体的不良反应。本课题组前期研究采用链脲佐菌素(STZ)制备2型糖尿病大鼠模型，发现丝胶水提物可有效降低血糖、调节血脂代谢紊乱、保护胰岛β细胞、海马、性腺及肾脏，并且丝胶水提物预处理亦有类似的作用。但丝胶水提物降低血糖、保护胰岛β细胞的机制尚需进一步的深入研究。为进一步探讨丝胶蛋白降低血糖的作用机制，本研究以STZ诱导大鼠胰岛细胞株INS-1损伤，观察丝胶蛋白对胰岛细胞株INS-1凋亡相关因子B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响，为进一步探讨丝胶蛋白治疗糖尿病的分子机制奠定一定的理论基础。

1.2.2 CCK-8法检测各组细胞存活率 取3组对数生长期细胞接种于96孔板，5×103个/孔，每组设5个复孔，分别设空白组(只加培养基不加细胞)、正常组、药物组(STZ组和丝胶蛋白组)。每孔加入5 mg/ml CCK-8，培养2 h，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度值(A值)，取平均值，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(药物组A值-空白组A值)/(正常组A值-空白组A值)×100%。实验重复4次，取平均值。

1.2.3 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 各组细胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化后，每管取1×106个细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，将细胞重悬于500 μl Binding Buffer中，加入5 μl Annexin Ⅴ/PI，柔和混匀，避光孵育5 min，流式细胞术检测细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.2.4 RT-PCR法检测Bcl-2、Bax mRNA的表达 Trizol法提取各组细胞总RNA，以1 μg RNA为模板反转录为cDNA，分别对目的基因Bcl-2、Bax和内参基因β-actin进行RT-PCR扩增。Bcl-2上游引物：5′-GACTGAGTACCTGAACCGGCATC-3′，下游引物：5′-CTGAGCAGCGTCTTCAGAGACA-3′，长度135 bp；Bax上游引物：5′- AGACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′ ，下游引物：5′-TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′，长度196 bp；β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′， 下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，长度186 bp。RT-PCR采用SYBR GreenⅠ法，于Agilent Mx3000P USA上检测荧光超过背景荧光时的循环数定义为循环阈值(cycle threshold，Ct值)。使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂(日本TaKaRa 公司)进行RT-PCR。反应体系20 μl：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，cDNA 2 μl，灭菌蒸馏水6 μl，10 μmol/L上游引物及下游引物各0.8 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次，分析熔解曲线。反应结束后Setup MxPro v4.10系统会自动出现Ct值，按照2-ΔΔCt法计算基因的相对量。实验重复3次，取平均值。

1.2.5 Western blotting法检测Bcl-2和Bax的表达 提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后每孔加样30 μg，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，稳压电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(Bcl-2、Bax、β-actin：1∶1 000)孵育2 h，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL发光，胶片感光。胶片扫描后，应用Quntity One 4.6.2软件测量条带的灰度值，以Bcl-2、Bax条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值，作为Bcl-2、Bax的相对表达水平。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 丝胶蛋白对胰岛细胞株INS-1细胞存活率的影响 3组胰岛细胞株INS-1细胞存活率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中STZ组胰岛细胞株INS-1细胞存活率较正常组降低，丝胶蛋白组胰岛细胞株INS-1细胞存活率较STZ组升高，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 3组胰岛细胞株INS-1细胞存活率比较

注：STZ=链脲佐菌素；与正常组比较，aP<0.05；与STZ组比较，bP<0.05

2.2 丝胶蛋白对胰岛细胞株INS-1细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，3组胰岛细胞株INS-1细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中STZ组胰岛细胞株INS-1细胞凋亡率较正常组升高，丝胶蛋白组胰岛细胞株INS-1细胞凋亡率较STZ组降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图1)。

表2 3组胰岛细胞株INS-1细胞凋亡率比较

注：与正常组比较，aP<0.05；与STZ组比较，bP<0.05

2.3 丝胶蛋白对胰岛细胞株INS-1 Bcl-2、Bax mRNA表达的影响 3组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2、Bax mRNA表达水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中STZ组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2 mRNA表达水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA较正常组降低，Bax mRNA表达水平较正常组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；丝胶蛋白组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2 mRNA表达水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA较STZ组升高，Bax mRNA表达水平较STZ组降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

注：PI=碘化丙啶，STZ=链脲佐菌素

图1 流式细胞术检测3组胰岛细胞株INS-1细胞凋亡率

Figure 1 Apoptosis rate of INS-1 cells in three groups measured by flow cytometry

Table3ComparisonofBcl-2andBaxmRNAexpressionlevelsinINS-1cellsamongthreegroups

组别Bcl-2mRNABaxmRNABcl-2mRNA/BaxmRNA正常组1.001.001.00STZ组0.84±0.08a2.33±0.32a0.36±0.02a丝胶蛋白组0.92±0.03b1.10±0.11b0.85±0.11bF值6.70842.97578.236P值<0.05<0.01<0.01

注：Bcl-2=B淋巴细胞瘤2，Bax=Bcl-2相关X蛋白；与正常组比较，aP<0.05；与STZ组比较，bP<0.05

Table4ComparisonofBcl-2andBaxexpressionlevelsinINS-1cellsamongthreegroups

组别Bcl-2BaxBcl-2/Bax正常组0.070±0.0120.344±0.0062.020±0.009STZ组0.038±0.007a0.712±0.023a0.534±0.017a丝胶蛋白组0.527±0.012b0.377±0.021b1.402±0.110bF值1333.925379.975403.340P值<0.01<0.01<0.01

注：与正常组比较，aP<0.05；与STZ组比较，bP<0.05

2.4 丝胶蛋白对胰岛细胞株INS-1 Bcl-2、Bax表达的影响 3组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2、Bax表达水平、Bcl-2/Bax比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中STZ组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2表达水平、Bcl-2/Bax较正常组降低，Bax表达水平较正常组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；丝胶蛋白组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2表达水平、Bcl-2/Bax较STZ组升高，Bax表达水平较STZ组降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表4、图2)。

注：Bcl-2=B淋巴细胞瘤2，Bax=Bcl-2相关X蛋白

图2 Western blotting法检测3组胰岛细胞株INS-1 Bcl-2、Bax表达

Figure 2 Expressions of Bcl-2 and Bax in INS-1 cells in three groups detected by Western blotting

3 讨论

除胰岛素抵抗之外，胰岛β细胞功能减退甚至缺陷是2型糖尿病另一个重要发病机制[5]，而胰岛β细胞凋亡增加则是胰岛功能减退的基础[6]。因此，保护胰岛β细胞、针对胰岛β细胞功能减退是2型糖尿病治疗的关键。糖尿病的治疗目前没有特效药物，西医主要通过口服降糖药物或皮下注射胰岛素治疗糖尿病，以及辅以饮食控制、适量运动，不良反应时有出现[7]。而中药具有多靶点整体调节优势，能够有效缓解糖尿病症状，纠正糖代谢紊乱，且不良反应小[8]。丝胶蛋白是从天然彩色蚕茧中提取的水溶性球蛋白，由18种氨基酸组成[9]，具有生物相溶性，可生物降解，对人体无毒性，可避免化学合成药物带给人体的不良反应。本课题组前期以STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，并给予丝胶水提物(主要成分为丝胶蛋白)灌胃，发现丝胶水提物可明显降低2型糖尿病模型大鼠的血糖水平[4]；另外，丝胶蛋白还可通过调节GH/IGF-1轴改善2型糖尿病大鼠的生殖功能[10]以及通过上调神经微丝蛋白、下调神经肽Y保护2型糖尿病所致的坐骨神经和相关神经元损伤[11]。但丝胶蛋白降血糖的机制尚不清楚。本研究建立了STZ诱导大鼠胰岛细胞株INS-1损伤模型，同时给予丝胶蛋白干预，通过检测胰岛细胞株INS-1细胞凋亡及观察凋亡相关因子Bcl-2、Bax表达的变化，探讨丝胶蛋白是否对胰岛细胞株INS-1的凋亡具有抑制作用。

Bcl-2家族蛋白可通过改变线粒体外膜的通透性而调控线粒体活化，在线粒体诱导的凋亡途径中起重要作用[12]，该家族蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其中Bcl-2属于抗凋亡蛋白，与Bcl-2同源的Bax则属于促凋亡蛋白。Bcl-2蛋白可通过调控细胞膜的通透性来阻止细胞色素C的释放，从而阻止细胞凋亡级联反应[13]，而Bax可在细胞遭受损伤时移位到线粒体膜而引发凋亡过程[14]，当Bax大量表达时，细胞对凋亡信号的反应增强，细胞凋亡增多[15]。 Bcl-2与Bax的作用互相拮抗，当细胞受到促凋亡因素刺激时，二者的比率决定细胞的存亡[16]。

本研究结果显示，丝胶蛋白组胰岛细胞株INS-1细胞存活率升高，细胞凋亡率下降，Bcl-2 mRNA及其蛋白表达水平升高而Bax mRNA及其蛋白表达水平下降，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA及Bcl-2/Bax升高，说明丝胶蛋白可以抑制STZ诱导的胰岛细胞株INS-1细胞凋亡而具有细胞保护作用，推测本课题组前期研究的丝胶水提物的降糖作用可能通过抑制胰岛β细胞凋亡实现，但其具体作用机制还有待进一步研究。

作者贡献：陈志宏进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，论文的修订，对文章整体负责，监督管理；王小杰、刘美晓、谢云鹏、毛晓霞、孙一婵进行数据收集；王小杰进行数据整理，统计学处理，撰写论文，负责文章的质量控制及审校；王小杰、刘美晓、陈志宏进行结果的分析与解释。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Effect of Sericin on Apoptosis Related Factors in Streptozotocin-induced INS-1 Cells

WANGXiao-jie1,LIUMei-xiao1,XIEYun-peng2,MAOXiao-xia3，SUNYi-chan1，CHENZhi-hong4*

1.InstituteofBasicMedicalSciences,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China2.DepartmentofNeurosurgery,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China3.InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China4.DepartmentofHumanAnatomy,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China*Correspondingauthor：CHENZhi-hong，Professor；E-mail：czh1971@163.com

Objective To investigate the effect of sericin on apoptosis related factors Bcl-2 and Bax in Streptozotocin(STZ)-induced INS-1 cells.Methods This study was conducted from June 2015 to March 2016.INS-1 cells were divided into normal group(without any treatment),STZ group(STZ addition) and sericin group(STZ and sericin treatment).The survival rate of INS-1 cells was measured with CCK-8 assay.Apoptosis rate of INS-1 cells was detected with flow cytometry.The expression of apoptosis related factors Bcl-2 and Bax mRNA and protein were determined by RT-PCR and Western blotting,respectively.Results Compared with the STZ group,both the normal group and the sericin group had higher survival rate of INS-1 cells(P<0.05).Flow cytometry assay found that,both the normal group and sericin group had lower apoptosis rate of INS-1 cells than STZ group did(P<0.05).Compared with the normal group,the STZ group had lower expressions of Bcl-2 mRNA and protein,Bcl-2 mRNA/Bax mRNA and Bcl-2/Bax(P<0.05),but higher expressions of Bax mRNA and protein in INS-1 cells(P<0.05).Higher expressions of Bcl-2 mRNA and protein,Bcl-2 mRNA/Bax mRNA and Bcl-2/Bax and lower expressions of Bax mRNA and protein in INS-1 cells were observed in the sericin group compared with the STZ group(P<0.05).Conclusion Sericin could inhibit the apoptosis of STZ-induced INS-1 cells,and increase the Bcl-2/Bax ratio.

Sericins；Streptozocin；Apoptosis inducing factor；Genes,Bcl-2；Bcl-2-associated X protein

国家自然科学基金资助项目(81441133)；河北省自然科学基金资助项目(H2013406096)；河北省教育厅青年基金项目(QN20131089)

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.14.010

2017-01-03；

2017-03-21)

1.067000河北省承德市，承德医学院基础医学研究所

2.067000河北省承德市，承德医学院附属医院神经外科

3.067000河北省承德市，承德医学院中药研究所

4.067000河北省承德市，承德医学院人体解剖学教研室

*通信作者：陈志宏，教授；E-mail：czh1971@163.com