不同浓度海藻糖对牛冷冻精液品质的影响

赵占强，周玉香，洪 涛

(1.宁夏中卫山羊选育场,宁夏中卫 755006；2.宁夏大学农学院,宁夏银川 7550021； 3.中卫市沙坡头区农业和科技委员会,宁夏中卫 755000)

不同浓度海藻糖对牛冷冻精液品质的影响

赵占强1，周玉香2，洪 涛3

(1.宁夏中卫山羊选育场,宁夏中卫 755006；2.宁夏大学农学院,宁夏银川 7550021； 3.中卫市沙坡头区农业和科技委员会,宁夏中卫 755000)

【目的】为提高牛冷冻精液的保存效果，【方法】本试验在新采集的牛精液中添加其他物质的基础上添加0mol/L，0.014 mol/L ，0.028mol/L，0.042 mol/L浓度的海藻糖，比较不同浓度海藻糖对低温保存牛精液品质的影响。【结果】表明：在相同的保存时间下，海藻糖浓度为0.042 mol/L时，精子活力最高，精子畸形率最低，对牛冷冻精液保存效果最佳。【结论】说明海藻糖浓度在0.042mol/L时，对牛精液冷冻保存伤害最小。

牛精液；海藻糖；低温保存；精液品质

海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷键构成的非还原性糖，自身性质非常稳定，具有独特的生物学特性，对生物有抗脱水、抗冷冻保护作用和抗高渗保护作用，同时海藻糖还有防止淀粉老化、防止蛋白质变性、抑制脂类物质酸败、抑制鱼腥味的生成、矫正味道和矫正气味、抑制大米的米糠臭、保鲜、稳定超氧化物歧化酶和补充能源等功能特性[1]。

试验在采集的牛精液中添加其他物质的基础上,添加不同浓度的海藻糖作为冷冻保护剂，在相同存放条件下，相同存放时间内，对比找出精子活力高，精子畸形率低的最佳浓度的海藻糖，以提高精液解冻后的活力和保护效果，从而提高受精率。

1 材料和方法

1.1 牛精液的采集

本试验所选取的种公牛是来自宁夏某肉牛场的种公牛，选择年龄为2～3岁，健康无病，繁殖性能好的5头西门塔尔种公牛，假阴道法采精，采精频率每周2次。

1.2 试剂与耗材

主要试剂：果糖，Tris，海藻糖，柠檬酸，姬姆萨染色液、蒸馏水、青霉素、链霉素。

主要耗材：相差显微镜、电子天平、恒温水浴箱、5.0 mL试管、试管架、载玻片、盖玻片、血细胞计数器、移液枪、250 mL烧杯、100 mL量筒、玻璃棒、定性滤纸、消毒纸巾、硫酸纸、灭菌牛皮纸、5 mL注射器、在保持渗透压不变的情况下配制不同浓度海藻糖：A组：0 mol/L为对照组，B组：0.014 mol/L，C组：0.028 mol/L，D组：0.042 mol/L。

2 具体试验方法[1]

2.1 精液的采集

精液用假阴道采集。向假阴道内注入38℃左右的温水，内胎前三分之二处用涂抹棒均匀涂擦适量消毒凡士林润滑剂，并从活塞孔打气，使假阴道有适度的压力。将采精公牛包皮清洗干净，采精前先让公牛空爬一次，采精员右手持假阴道，站在公牛右后方，当公牛起跳，前肢爬上台牛时，迅速向前用左手托着公牛包皮，右手持假阴道与台牛成40度角，假阴道口斜向下方，左右手配合将公牛阴茎自然地引入假阴道内，公牛往前一冲即完成射精动作，公牛随即而下，采精员右手紧握假阴道，随公牛阴茎而下，待公牛前肢落地时，缓慢地把假阴道脱出，立即将假阴道口斜向上方，打开活塞放气，使精液尽快地流入集精管内，然后小心地取下集精管，迅速送至精液处理室。

2.2 精液的稀释与保存

采集精液进行活力检测，将等温稀释液与合格精液混合进行稀释；按照试验方案分组，并在试管上做标记，保存在集精杯(37℃)中静置30 min，使精子与稀释液充分接触，然后放入4℃冰箱，用8层纱布覆盖在集精杯口，每隔24 h观察1次，并记录结果。

2.3 精子的活力检测

将低温保存的稀释精液摇匀后,取中层精液10 μL在37℃恒温板上等温预热的载玻片上滴片,盖上盖玻片后置于配有37℃恒温台的显微镜下放大400倍检查200个以上精子,分别统计呈直线运动的精子数占精子总数,计算精子活力。活力评定一般采用十级评分法，即按呈前进运动的精子所占百分率分别评为1.0、0.9、0.8……0等10个等级，若无前进运动的精子，则以“0”表示之。例如“0 .8”就表示呈前进运动的精子数占总精子数的80%。“1.0”则表示100%的精子呈前进运动。

2.4 精子畸形率的的检测

将低温保存好的精液取出解冻后，滴一滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片将样品均匀地涂于载玻片上，每一样品制作两个抹片。自然晾干后，用中性福尔马林固定15 min，水洗后吹干或晾干，用姬姆萨染色液染色1.5 h，清水漂洗后晾干。在显微镜(400～600倍)下，每个抹片观察200个以上精子(分左、右二个区)，按下面公式计算精子畸形率。

A=Al÷S×100

其中A：畸形率即顶体完整率，A1：畸形精子数；S：精子总数

2.5 数据统计分析

试验数据用SAS8.2软件包进行方差分析，试验结果以±SD表示，并采用t检验检验其差异显著性[2]。

3 结果与分析

由表1可知 ，在相同条件，相同保存时间下，随着时间的延长，各组精子的活力都呈现下降趋势，96 h前，A、B、C、D四组精子活力下降不明显，差异不显著(P>0.05)；144 h时，A、B、C、D四组精子活力下降明显，A组精子活力下降最快，D组精子活力下降最慢，C组与A组差异显著(P<0.05)。由表2可知，同一保存时间下，添加不同浓度的海藻糖，D组的精子畸形率最低，D组与A、B、C组精子畸形率比较差异显著(P<0.05)，而A、B、C组间的精子畸形率差异不显著(P>0.05)。

注：同列数字肩上有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，有不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表2 各组精液精子在相同保存时间下畸形率情况

注：同行数字肩上有相同字母表示差异不显著，有不同字母表示差异显著。

4 小结与讨论

评定精子品质的指标较多，活力反映精子直线前进运动的能力，活力与精子的运动能力密切相关，在获能、顶体反应和受精过程中，精子膜必须具有生化活性。若精子质膜受到损伤，则直接导致精子活力和受精能力下降[3]。本试验采用测定精子活力和畸形率来研究牛精子的品质，从结果可以看出，在低温保存条件下稀释液中添加适当浓度海藻糖，随着时间延长，可以有效的提高精子的活力，并降低精子的畸形率，与不添加海藻糖的对照组差异显著。

4.1 海藻糖对低温保存精液活力的影响

张树山等研究发现在猪的冷冻稀释液中添加海藻糖可提高冻后精子的活率、顶体完整率、膜功能的完整率等指标[4]。海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。本试验中，添加不同浓度的海藻糖在24 h、48 h、72 h、96 h时差异不显著(P>0.05)。在144h时差异显著(P<0.05)。表明随着保存时间的延长，海藻糖的特性就发挥的越好，特别是添加0.042 mol/L时精子的存活力差异就越显著。

4.2 海藻糖对低温保存精液畸形率的影响

Molinia[5]等研究表明，在稀释液中没有甘油存在的情况下，蔗糖或海藻糖的存在使绵羊精子解冻后的活率比葡萄糖存在时高，说明二糖具有冷冻保护作用。据报道绵羊精液中添加 0.2 mol/L 海藻糖经冷冻解冻后可显著地降低畸形率[6]。试验中的结果显示，在精液中添加0.042 mol/L的海藻糖对精子畸形率的影响明显的低于其他三组，并且差异显著。表明冷冻精液稀释液中添加0.042 mol/L的海藻糖可有效使精子的畸形率下降。

[1] 桑润滋编.动物繁殖生物技术[M].中国农业出版社,2002.

[2] 贵州农学院主编.生物统计附试验设计[M].北京：中国农业出版社，1999.

[3] 胡建宏,李青旺,江中良,海藻糖对猪精液冷冻保存效果的影响[J]畜牧兽医学报,2006, 37(12):12-18.

[4] 张树山，李青旺，李刚等.海藻糖、蔗糖和乳糖对猪精液冷冻保护效果的影响[J], 西北农林科技大学学报,2006,34(6):41-45.

[5] Molinia FC, Evans G, Casares PI, Maxwell WMC. Effect of monosaccharides and disaceliaridesin Tris-based diluents on motility ,acrosome integrity and fertility of pellet frozen ram spermatozoa[J]. Anim Reprod Sci, 1994,36:13-22.

[6] 徐振军,车世德,赵冰等. 绒山羊精液低温保存技术研究[J], 黑龙江畜牧兽医， 2009,52(10):29-30.

Effect of Different Concentrations of Trehalose on Cattle Frozen Semen

ZHAO Zhan-qiang1, ZHOU Yu-xiang2, HONG Tao3

(1.Goatbreedingfarmofzhogwei,zhongwei,Gansu, 755006; 2.Agriculturalcollege,NingxiaUniversity,Yinchuan,Gansu, 7550021)

:【Objective】To improve the preservation results of cattle frozen semen 【Method】 The experiment added the trehalose of different concentration (0 mol/L, 0.014 mol/L, 0.028mol/L, 0.042 mol/L) into the new collected cattle semen with the basis of other additives in order to compare the effect of different concentrations of trehalose on cattle frozen semen 【Result】Under the same preservation time, when the concentration of trehalose was 0.042 mol/L, sperm motility was the highest and sperm abnormality rate was the lowest, and the preservation effect of cattle frozen semen was the best 【Conclusion】Our study illustrated that the harm for the preservation of cattle frozen semen could be minimized when the concentration of trehalose is 0.042mol/L.

cattle semen; trehalose; cryopreservation; semen quality

2016-11-17 接收日期:2016-12-05

赵占强(1985-)，男，汉，宁夏银川人，本科，专业：动物医学，从事工作：中卫山羊的品种保护。

S823.2

A

1001-9111(2017)01-0023-03