颈静脉灌注混合氨基酸对奶牛阴外动脉氨基酸组成比例的影响

张 鑫，丁洛阳，王梦芝*，周 刚，徐巧云，张 军,2

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.扬州市扬大康源乳业有限公司，江苏扬州 225004）

颈静脉灌注混合氨基酸对奶牛阴外动脉氨基酸组成比例的影响

张 鑫1，丁洛阳1，王梦芝1*，周 刚1，徐巧云1，张 军1,2

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.扬州市扬大康源乳业有限公司，江苏扬州 225004）

本试验拟通过以颈静脉灌注氨基酸混合液的方式，探索颈静脉与阴外动脉中氨基酸浓度和组成比例的关系。将3头体重、胎次、泌乳期、泌乳量和体况基本一致的荷斯坦奶牛按3×3拉丁方试验设计，以不同的3种氨基酸混合液分3个周期进行颈静脉灌注，每期 22 d（7 d 灌注期+15 d 间隔期）。在每个灌注期的7 d采集血样，在当天灌注开始后的0、0.5、1、2、4 h进行采样。结果表明：灌注液所含的6种氨基酸在颈静脉和阴外动脉中的浓度呈三次方相关，并在一定范围内呈线性相关；其他所测的氨基酸除了天冬氨酸和酪氨酸之外，也具有三次方相关及一定范围内线性相关；颈静脉和阴外动脉中的氨基酸组成比例也具有相关性。综上，除了天冬氨酸和酪氨酸外，颈静脉与阴外动脉氨基酸的浓度和组成比例具有一定的相关性，可采用颈静脉灌注替代阴外动脉灌注进行相关种类氨基酸的研究。

颈静脉；阴外动脉；氨基酸；组成比例；相关性

乳腺对氨基酸的摄取和利用对乳蛋白的合成和乳产量的保证极其重要。乳腺中乳蛋白的合成需要由阴外动脉血液中供应的游离氨基酸作为主要的前体物质，阴外动脉中的氨基酸平衡直接关系到乳品质，对于乳用动物生产潜能的充分发挥具有重要意义。因此，近几年来反刍动物营养代谢研究中，以阴外动脉灌注氨基酸为方法开展乳腺中乳蛋白合成的研究得到广泛应用[1-5]，试验技术也愈发成熟。然而，这种试验方法的手术难度大，手术过程中对试验动物伤害也较大，会对动物造成较强的应激[6]，因此在实际应用中对技术和条件的要求甚高，不易操作。颈静脉灌注手术难度相对较低，造成的应激也相对较小。然而在动物的血液循环系统中，颈静脉在位置上远离阴外动脉和乳腺，又属于前腔静脉范畴，其中的血液需先与后腔静脉汇合回流至心肺系统转变为动脉血然后才输送至动脉为机体供养供能。所以，氨基酸随血液从颈静脉流经阴外动脉的过程中会经历多种多样的代谢过程并使浓度产生变化，颈静脉和阴外动脉中各种氨基酸浓度有哪些存在显著差异？又或者是否具有相关性？本试验尝试从颈静脉灌注氨基酸，测定分析灌注开始后不同时间点奶牛外周血液循环中游离氨基酸的浓度，以期得出颈静脉和阴外动脉中氨基酸组成比例的相关性，从而为颈静脉灌注氨基酸替代阴外动脉来开展乳腺合成的相关研究提供依据和参考。另外，针对颈静脉的替代灌注可行性的探讨，对于奶牛生产中的特殊营养液灌注也可能有一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试验设计 在扬州大学实验农牧场选取3头体重、胎次（4胎）、泌乳期（80±2）d、产奶量（21.01±1.0）kg、体况等基本一致的荷斯坦奶牛。奶牛的基础日粮由扬州大学实验农牧场提供，参照NRC[7]奶牛饲养标准配制（表1）。试验奶牛被拴养于同舍的独立围栏内。每天于09:00和15:00等量喂料，自由饮水。每日挤奶3次，时间分别为07:00、15:00和23:00。试验奶牛的饲养管理均保持一致。

本试验采用3×3拉丁方试验设计，处理方法分别为氨基酸混合液1、氨基酸混合液2、氨基酸混合液3（表2）。氨基酸灌注溶液主要成分分别为奶牛的第一和第二限制性氨基酸赖氨酸和蛋氨酸，潜在的限制性氨基酸苯丙氨酸和异亮氨酸，生长牛的限制性氨基酸精氨酸以及等氮量替代精氨酸的丙氨酸（对于第三限制性氨基酸组氨酸和潜在限制性氨基酸亮氨酸，由于在调整酪蛋白组成配比时基底浓度过高，难以配制，故未选用）。牛奶中的蛋白质主要以酪蛋白为主，为模拟这种比例而参照王世润[9]的研究结果，以酪蛋白组成的氨基酸浓度比例为基准，由江苏南京剑桥生物科技有限公司配制而成。每个试验期为22 d，其中灌注期7 d，间隔休息期15 d。灌注氨基酸溶液通过在奶牛颈静脉安插留置针并匀速滴注的输液方式进行，每天灌注前以无菌肝素钠生理盐水疏通留置针2次。每头牛每日灌注量为2 L（瓶装500 mL，共4瓶），按每瓶耗时1 h的速度连续滴注4 h，期间采食、饮水、挤奶正常进行。

1.2 血液样品的采集 血液样品的采集在每个周期灌注的第7天进行，以采血针分别在3头牛的颈静脉和阴外动脉进行采集（颈静脉采血点与灌注处相同），采血时间点为灌注前（0 h）和开始灌注后0.5、1、2、4 h。血样收集与EDTA抗凝真空采血管中，经3 000 × g，4℃离心 15 min 分离血浆，-20℃保存待测。

表1 基础日粮的组成及营养成分（干物质基础）

表2 各组氨基酸混合液的浓度 g/L

1.3 血液样品氨基酸的分析 血浆中的各氨基酸浓度分析参考Noguchi等[10]的方法，待测血浆中加入等量的8%磺基水杨酸充分混合，4℃静置过夜，12 000 × g离心20 min，用0.22 μm滤器过滤后由日立L8900氨基酸自动分析仪（日本）检测。

1.4 统计分析 试验数据分析使用SPSS 16.0软件，选用GLM模型中Univariate程序和Duncan's法，进行方差分析和多重比较，差异显著性水平为P＜0.05，极显著为P＜0.01。数学模型：

其中，μ为平均值，Ti为处理效应，Pj为灌注期的随机效应，Ck为奶牛的随机效应，eijk为服从正态分布的随机误差。

2 结果与分析

2.1 颈静脉与阴外动脉中灌注液氨基酸浓度关系 分别以6种氨基酸浓度为指标，将不同时间点和不同氨基酸混合液灌注组的数据统一为重复进行拟合，做出颈静脉与阴外动脉中氨基酸浓度的相关性。以氨基酸在颈静脉中的浓度为自变量（x），以氨基酸在阴外动脉中的浓度为因变量（y），对二者进行一次、二次和三次回归分析，得出三次方回归分析的相关性最为显著。表3表示拟合方程及其显著性检测结果。

表3 颈静脉中氨基酸（x）与阴外动脉中氨基酸（y）浓度的关系

从三次方拟合结果可以看出，灌注液包含的各种氨基酸在颈静脉和阴外动脉中的浓度虽非线性关系，但所有图像三次方曲线部分走势较为平滑并近似直线，提示这些氨基酸在一定的浓度范围内，在颈静脉和阴外动脉中可能存在某种线性关系（表4）。于是在形成表3的数据基础上，筛去颈静脉浓度中过高与过低的若干个点，重新分析二者的线性关系。如图1所示，这6种氨基酸在颈静脉与阴外动脉中的浓度呈现出良好的线性关系，表明颈静脉内氨基酸在一定的浓度范围内所产生的变化，相对应的在阴外动脉中的的浓度也会保持大致相同的趋势。

图1 颈静脉与阴外动脉中氨基酸浓度在一定范围内的线性关系

图1显示，灌注液中所包含的6种氨基酸在颈静脉与阴外动脉中所表现出相关性的范围各有差别。以颈静脉中氨基酸浓度的数据点的最小值和最大值来界定线性关系的范围，其中Ala的浓度范围约为17～29 ng/μL，Lys的浓度范围约为17～37 ng/μL，Met的浓度范围约为7～20 ng/μL，Phe的浓度范围约为13～28 ng/μL，Ile的浓度范围约为14～34 ng/μL，Arg的浓度范围约为17～37 ng/μL。

表4 颈静脉中氨基酸（x）与阴外动脉中氨基酸（y）浓度在一定范围内的线性关系

2.2 其他氨基酸在颈静脉和阴外动脉中浓度的比较 从表5可以看出，颈静脉与阴外动脉氨基酸部分氨基酸浓度的三次方拟合结果相关性较低，如天冬氨酸、丝氨酸和组氨酸，但其显著性明显（Sig. ＜ 0.05）；其他氨基酸成分浓度相关性较强，尤其是甘氨酸可呈现线性关系，而呈三次方相关的氨基酸浓度的曲线在截取其中的一部分后，也可以线性相关来表示。这表示这些非灌注的氨基酸在颈静脉和阴外动脉中的浓度在一定范围内呈正比关系。而对于酪氨酸，可从附图上的数据点分布看出离散程度较高，且相关性不显著（Sig. ＞ 0.05）。

根据三次方拟合曲线结果再次对可能部分符合线性相关条件的氨基酸进行数据筛选，去掉若干浓度过高的数据，再重新进行线性拟合（图2），得出线性参数并列出线性回归方程（表6）。由于Asp和Tyr的三次方曲线数据点离散程度过高，不易于筛选并拟合出相关性良好的线性关系，故予以舍弃。2.3 颈静脉与阴外动脉氨基酸比例关系 Bach等[11]研究指出，奶牛乳腺存在理想的氨基酸供应模式，该模式使蛋白质合成和氨基酸利用效率达到最优化。所以，在比较了各种氨基酸在颈静脉和阴外动脉中浓度的相关性之后，还将所测的Ala、Lys、Met、Phe、Ile、Arg，以及灌注液所不包含的Asp、Ser、Thr、Glu、Gly、Cys、Val、Leu、Tyr、His和Pro的浓度转化成与相对应的Lys浓度之比并计算出均值（表7），再以不同的牛做为重复，分别以灌注后不同时间点分析2个部位的血液中氨基酸组成的相关性（表8）。

表5 颈静脉中氨基酸（x）与阴外动脉中其他氨基酸（y）浓度的关系

表6 其他氨基酸在颈静脉中浓度（x）与阴外动脉中浓度（y）在一定范围内的线性关系

如表8所示，各时间点的显著性均为0.000 （Sig.＜ 0.05），表示各相关显著，其中灌注后0 、0.5、1 h氨基酸组成比例在颈静脉和阴外动脉的相关性属于中等程度相关，而2 h和 4 h 数据的相关性程度较强。

图2 颈静脉与阴外动脉其他氨基酸浓度的线性关系

表7 不同时间点颈静脉和阴外动脉氨基酸组成比例比较 %

表8 颈静脉和阴外动脉中氨基酸组成比例的相关性

3 讨 论

3.1 颈静脉与阴外动脉氨基酸三次方回归关系分析 本试验结果表明，颈静脉和阴外动脉中浓度可呈三次方回归关系的氨基酸包括Lys、Met、Phe、Ile、Arg、Ser、Thr、Glu、Cys、Val、Leu、His以及Pro。其成因可以从附图的拟合曲线走势看出，曲线先出现一段平稳的上升后出现了拐点，这就意味着颈静脉和阴外动脉中的浓度在一定范围内存在线性相关，而处于血液循环上游的颈静脉浓度一旦超出一定范围时，就可以用三次方的拟合回归方程来表达二者之间的关系，即阴外动脉血液中氨基酸浓度不再因为颈静脉浓度的增长而增长，其表现可能是进入一个平台期，也可能是开始下降后再上升，这说明此时的氨基酸浓度已经开始受到机体的维持调控作用，如肝脏能根据氨基酸的进入量进行代谢，去除一些无用而过量的氨基酸。肝脏是机体氨基酸代谢的主要场所，Raggio等[12]研究证明奶牛门静脉的总氨基酸中有近一半的氨基酸可在肝脏内转化；此外，血液中的氨基酸还被其他的外周组织利用以及受到激素的调控作用。而本试验中氨基酸浓度拟合曲线的“先降后升”阶段则可能是颈静脉中氨基酸浓度过高而超出了内环境稳态的调控范围造成的。

3.2 颈静脉与阴外动脉氨基酸的线性关系分析 本试验结果表明，颈静脉和阴外动脉中的大部分氨基酸浓度在一定范围内存在线性关系。

在外周血液循环中，游离氨基酸的主要来源是肠道吸收经门静脉进入肝脏再由肝静脉进入循环，而进入循环的氨基酸只占门静脉摄入的一小部分，由于肝脏是机体内氨基酸的主要代谢器官，大部分游离氨基酸都在肝脏内被清除，例如被转化为特殊代谢物、氧化供能以及合成并入肝脏和外运蛋白，因此肝脏控制着血液循环中游离氨基酸的摄入。对于输出方面，反刍动物的氨基酸吸收后向外周组织分配的氨基酸比例小[13]，而乳腺中乳蛋白的合成则是循环中游离氨基酸输出的主要途径。所以，通过门静脉摄入和肝脏代谢作用，以及乳腺合成乳蛋白后输出，游离氨基酸在外周循环中基本保持在一个动态的平衡状态，这就使颈静脉和阴外动脉中一些氨基酸在一定浓度范围内出现线性相关成为可能。

对于Ala和Gly来说，试验数据所得的图像可直接以线性关系代表，说明这两种氨基酸在本试验条件下未超出阴外动脉所能维持的颈静脉中的浓度线性关系范围，说明这两种氨基酸的浓度在血液循环中相对稳定（Ala浓度＜30 ng/μL，Gly浓度＜35 ng/μL）。曾有研究结果表明，Ala和Gly等参与糖异生作用的氨基酸在肝脏代谢中被清除的数量最多[11,14-15]，所以外周循环中Ala和Gly的摄入受肝脏代谢的调控。根据Reynolds等[16]的报告，外周循环中的主要糖异生氨基酸可通过动员外周组织的储备得到补充。这就印证了本试验中Ala和Gly浓度较为稳定的结果。

还有一种就是难以证明在颈静脉和阴外动脉中具有任何浓度相关性的氨基酸，包括Asp和Tyr。其中，Asp由于总体浓度相对很低，所以在数据分析易造成相关系数较低，不满足统计条件。而对于后者Tyr，与本试验中所涉及其他氨基酸均不同，不存在三次方回归关系。Tyr浓度相关显著性极低（Sig.=0.534）表明，由颈静脉到阴外动脉这段的血液循环中，Tyr的代谢调控过程有异于其他各类氨基酸。可能的原因是，由于Tyr可特异性地用于合成甲状腺激素，所以颈静脉中Tyr浓度其实已受到甲状腺吸收合成甲状腺激素的影响，再加上流入心脏时已有后腔静脉的补充，所以阴外动脉中的Tyr浓度与颈静脉中的相关性极低，而且Tyr还可由Phe代谢产生，故具体的机体对Tyr的吸收和利用规律比较复杂，这方面有待进一步的研究和探索。

3.3 颈静脉与阴外动脉氨基酸比例的相关性分析 除了研究单一氨基酸浓度在颈静脉和阴外动脉的关系，进一步对二者间氨基酸组成比例的关系。因为影响乳腺内乳蛋白的合成因素除了氨基酸的浓度和乳腺对氨基酸转运能力之外，还有进入乳腺氨基酸的平衡性。Schwab等[17]研究表明，氨基酸的组成较饲料中蛋白含量对乳蛋白合成的影响更大，所以从颈静脉灌注的氨基酸混合液是否对阴外动脉中氨基酸组成比例有影响也需要通过验证。本试验结果说明，颈静脉和阴外动脉中的氨基酸组成可达到一般相关和较强相关，相关程度大致上随灌注时间的推移而递增。这可能是由于随着灌注的进行，内环境针对氨基酸浓度的变化产生的调控加强以达到维稳的效果。

4 结 论

本试验研究表明，除Asp和Tyr以外的氨基酸在颈静脉和阴外动脉的浓度均存在显著相关性，并且在一定的范围内呈正比，而且颈静脉和阴外动脉间氨基酸的组成比例也具有相关性，说明以颈静脉替代阴外动脉进行氨基酸灌注试验是可行的。今后在以灌注氨基酸方式来研究奶牛泌乳代谢的研究中，如果在条件不十分充足的情况下可对一部分氨基酸实行这种替代，一方面可降低对试验奶牛的应激和伤害，另一方面降低了试验难度并可提高安全保障。

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Effects of Amino Acids Infusion through Jugular Vein on Amino Acid Profile in External Pudic Artery of Cows

ZHANG Xin1, DING Luo-yang1, WANG Meng-zhi1*, ZHOU Gang1, Xu Qiao-yun1, ZHANG Jun1,2
(1. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Jiangsu Yangzhou 225009, China; 2. Yang Da Kang Yuan Dairy Company Limited, Jiangsu Yangzhou 225004, China)

The aim of this experiment was to investigate the correlation of concentration and ratio of different amino acids between jugular vein and external pudic artery. Thereby we tested the feasibility of that amino acids mixture infusion through jugular vein instead of external pudic artery. Three healthy lactating cows at similar body weights, parity, milk yield and body condition were selected and infused through jugular vein with 3 different amino acids mixture at 3 periods in 3×3 latin square trail (each period lasted for 22 d with 7-day infusion plus 15-day interval period). Blood samples were collected after infusing 0 , 0.5 , 1 , 2 h and 4 h at d 7 every period. The results showed that the concentration of amino acids gained from jugular vein and external pudic artery were cubic correlation, and had linear correlation in a certainty range; other amino acids except aspartic acid and tyrosine also had cubic correlation and linear correlation in certainty range; the proportion of amino acids between jugular vein and external pudic artery were also correlation. It is concluded that there is a correlation of amino acids concentration and amino acid profile between jugular vein and external pudic artery, so that amino acid infusion through external pudic artery could be replaced by jugular vein.

Jugular vein; External pudic artery; Amino acid; Profile; Correlation

S823.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-060

2017-01-28；

2017-04-11

江苏省自然科学基金项目（BK20141270、BK2015 1312）；扬州市产学研协同创新项目（SXT20140012）；江苏省优势学科（PAPD）

张鑫（1986-），男，江苏徐州人，硕士研究生，动物营养与饲料科学专业，E-mail: jiraiyi@qq.com

* 通讯作者：王梦芝，动物营养学博士，副教授，硕士生导师，

E-mail: mengzhiwangyz@126.com